神经细胞发育过程中钙调蛋白激酶I表达的调控机制

The goal of the proposed project is to determine the role of evolutionarily conserved non-coding DNA sequences and their interacting protein factors in regulating Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseIgamma(CaMKIgamma) expression during neuronal development. By identifying the enhancers and their trans-acting factors of CaMKIgamma, defining the function of enhancers and trans-acting factors during neuronal development, especially during dendritic development, are expected to provide novel understanding of the contribution of enhancers to neuronal development. In our preliminary experiments, we have identified two enhancer candidates (CR1 and CR5), which reproducibly drive the reporter gene (GFP) expression in mouse brain in a similar manner as CaMKIgamma?? expression.Moreover, our analysis of the GFP expression and antibody staining patter shows that GFP+ cells in VZ and hippocampus are also positively stained with DCX, whereas GFP+ cells in SVZ and RMS are positively stained with GFAP and nestin, suggesting that CR1 and CR5 maybe novel enhancers of CaMKIgamma for neuronal development. We will further define the enhancers of CaMKIgamma for dendritic development, identify enhancer-binding proteins and define the functional role of CaMKIgamma enhancers/transacting factors during neuronal development.

本项目拟探讨在神经细胞生长发育过程中,进化上保守的非编码DNA序列以及它们的互作蛋白是如何调节钙调蛋白激酶Igamma的表达以及对神经细胞发育所起的作用。通过鉴定CaMKIgamma基因的增强子序列以及其特定的调节蛋白，了解增强子和调节蛋白因子在神经细胞发育尤其是树突发育中的功能，并阐明神经细胞发育及树突发育的分子细胞机制。在我们的前期实验中，我们发现至少两个候选CaMKIgamma增强子序列（CR1和CR5）引导的GFP表达模式与该基因表达模式相吻合。此外，我们还观察到在脑室壁和海马神经元祖细胞内以及SVZ和RMS星型胶质细胞内观均有CR1和CR5引导的GFP表达。这些前期结果表明，CR1和CR5很可能是参与神经细胞发育过程的增强子。本项目将进一步确认与神经元发育尤其是树突发育相关的增强子序列，鉴定增强子结合蛋白，并在功能上确认增强子及其结合蛋白在神经细胞发育过程中的作用和机制。

大量的研究数据显示，CaMKIγ在海马神经元树突发育成熟过程中扮演着重要作用。同时，CaMKIγ的基因调节与多种疾病，如ALS的发生有着密切的联系。本项目拟探讨在神经细胞生长发育过程中，进化上保守的非编码DNA序列以及它们的互作因子是如何调节CaMKIγ的表达以及对神经细胞发育的作用的。我们的结果发现，过表达CaMKIγ能够显著促进体外神经元树突的生长，增加树突的分叉数量，而对轴突的生长没有显著的影响。利用在体电转手段，我们对预测的增强子片段进行了验证，发现了三个序列在表达模式上与CaMKIγ的表达的相似，而生物信息学的分析同时发现这三个序列存在多个与已知的反式作用因子的结合位点。进一步的分析发现在CaMKIγ的启动子序列同时存在miR135a和miR135b可能结合位点，说明CaMKIγ的表达可能同时受这两个microRNA的调控。通过荧光素酶报告基因方法，验证了该启动子确实与miR135a和miR135b存在相互作用。我们进一步探索了miR135a和miR135b能否通过CaMKIγ的表达对神经元树突发育进行调节。我们的结果显示，两个microRNA均抑制了神经元树突的长度。同时，实时定量PCR结果显示，miR135a显著抑制了CaMKIγ在原代神经元中的表达，说明miR135a通过影响CaMKIγ的表达影响神经元树突的发育。.我们的研究结果对 CaMKIγ在神经细胞发育及神经元树突发育过程中的作用提供了全新的认识，而对影响CaMKIγ表达的互作因子的鉴别也会对树突发育障碍相关疾病提供潜在的治疗靶点。