一个具有新型表型的甘蓝型油菜T-DNA插入突变体雌蕊发育的分子调控机理

The gynoecium development directly concerns the yield and quality of crop seeds and is a research hotspot in the world. However, knowledge about molecular regulation mechanism in gynoecium development of oilseed rape and other crops is lagging far behind, mainly because of the serious lack of the associated mutants. The preliminary work of the project obtained a T-DNA inserted Brassica napus mutant showing super long pistil phenotype and named it as Bnspt. The project will research the molecular regulation mechanism in the gynoecium development of the mutant. Its research significances are as follows: 1) The super long pistil of the Bnspt mutant leads to super long pod and super large seed, and 1000-seed weight increases by 101%, so the project has the important production significance in the improvement of yield. 2) The Bnspt mutant exhibits a new-style phenotype completely different from the female sterile phenotype of mutants presently used in the studies of the gynoecium development, so this project will obtain new discoveries completely different from previous. 3) The preliminary work of the project have cloned the T-DNA flanking sequence and its indicated gene, which lays the foundation for the develop of this project, further found that the T-DNA inserted into 3'-UTR region of the gene and led to significantly up-regulating expression of the gene, which will involve post-transcriptional control events. So the research on this new point of view will reveal a new regulation pattern of the plant gynoecium development.

雌蕊发育直接关系到作物种子的产量和质量，是世界性的研究热点。然而，油菜等作物雌蕊发育分子调控机理的研究严重滞后，其主要原因是相关突变体的严重缺乏。本项目前期获得了一个具有超长雌蕊表型的甘蓝型油菜T-DNA插入突变体，命名为Bnspt。本项目将研究这个突变体雌蕊发育的分子调控机理，其研究意义如下：⑴Bnspt突变体的超长雌蕊导致了超长角果和超大种子，千粒重增加了101%，因此本研究在提高产量上具有重要的生产意义；⑵Bnspt突变体展现一个新型表型，完全不同于目前研究雌蕊发育所用突变体的雌性不育表型，因此本研究将会获得完全不同于以前的新的发现；⑶本项目已经克隆到了Bnspt基因组T-DNA插入的侧翼序列及其指示的基因，这为本项目奠定了基础，进而发现T-DNA插入了这个基因的3'-UTR区，导致了其显著上调表达，这将涉及转录后调控事件，从这一新的角度去探讨将会揭示植物雌蕊发育的新的调控方式。

雌蕊最终能够发育成果实，对包括油菜在内的许多作物的种子产量和质量具有直接的、决定性的影响。本项目以一个具有超长角果表型的甘蓝型油菜T-DNA插入突变体Bnspt (B. napus super pistil mutant)为研究材料，进行该突变体雌蕊发育的相关研究。首先对Bnspt突变体进行表型的调查分析，结果显示，与未转化油菜植株（CK，对照）相比，展现出超长角果的表型的Bnspt突变体，种子体积增大，千粒重为6.61g，约为CK的2倍多。进而，使用RNA-Seq方法去分析Bnspt与CK之间的差异表达基因。GO富集结果显示，差异基因富集数目最多的是“Cellular Component”大类；KEGG通路富集分析发现，富集的差异基因最多的是蛋白质在内质网中的加工。我们进一步发现，生长素、细胞分裂素、赤霉素和油菜素内酯等信号途径均存在差异表达基因，建议这些信号途径均在Bnspt的雌蕊发育中起作用。进而我们克隆到了被插入的基因，命名为BnSPT。BnSPT编码一个由302个氨基酸组成的蛋白质，在角果和花中表达极为显著，表达量分别达到茎中表达量的71.92倍和11.01倍，建议BnSPT在角果和花的发育中起作用。此外，我们进一步发现突变体雌蕊中BnSPT的表达量显著高于CK。亚细胞定位分析显示，BnSPT定位于洋葱表皮细胞的细胞核中，表明它在细胞核中发挥作用。进一步实验发现油菜BnSPT过表达植株出现花蕾期柱头探出的表型，然而出现雄性不育的现象，导致不能收获T2代种子。这些现象表明BnSPT基因除了影响雌蕊的发育，也影响雄蕊正常发育，后续我们将对转化的油菜植株与雄蕊发育正常的未转化对照植株进行杂交来获得其后代种子，以便做进一步研究。我们依据转录组分析选择显著差异表达基因BnCPD进行进一步研究，结果发现，与对照相比，BnCPD的拟南芥转化植株角果长度显著增长，并且油菜过表达植株展现出角果长度显著增加和种子显著增大的表型。本研究从差异表达基因和植物激素角度初步阐明了Bnspt突变体雌蕊发育的分子机制，并且发现BnCPD在调控油菜角果长度和种子大小方面具有重要的作用。这些数据为油菜品种改良的分子遗传育种提供了理论指导和新的基因源。