淡紫拟青霉T-DNA插入突变体的获得和相关致病基因的克隆

淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus (Thom.) Samson 1974)是植物线虫生物防治有应用潜力的真菌之一。利用已建立的根癌农杆菌介导的淡紫拟青霉遗传转化体系，建立淡紫拟青霉T-DNA插入突变体库，从中筛选与致病力相关的淡紫拟青霉突变体，得到同致病相关的基因序列，并对这些基因进行功能研究。通过对这些致病基因的研究，为明确淡紫拟青霉与植物线虫的互作机制及构建淡紫拟青霉的高效生防菌株打下基础，因此该项研究在理论上和实践上都具有重要意义。

淡紫拟青霉被认为是一种能有效防治根结线虫的生防真菌。为了充分利用淡紫拟青霉，提高生物防治效果，构建的淡紫拟青霉突变体库，获得11000个淡紫拟青霉插入突变体。单孢分离，连续5代培养获得遗传稳定性的突变体。筛选突变体并研究表型、致病力和酶活力，为进一步的淡紫拟青霉致病机制分析及致病相关的基因克隆奠定基础。.PCR检测筛选的14株T-DNA插入突变体，观察和测定菌落形态，菌落生长速率，产孢量，孢子萌发率和菌丝干重等生物学性状，并比较突变体致病力。结果表明突变体均含有beta-tubulin基因序列，T-DNA已整合进入野生型菌株20-7的基因组中。通过与野生型对比，发现突变体菌落形态发生了不同程度的改变。菌落生长速率明显增大的菌株占全部菌株的85.71%，只有BN-11菌株的菌落生长速率降低。产孢量显著变大的菌株有BN-11和BN-12，为菌株总数的14.29%。孢子萌发率发生改变的菌株占78.57%。菌丝干重发生明显增大和减少的菌株分别都占全部突变体的21.43%。筛选获得了1株致病力增强的突变体BN-11和11株致病力显著降低的突变体。.几丁质酶和蛋白酶的活力结果表明两种酶由于T-DNA的插入均受到了不同程度的影响。野生型20-7在第5d几丁质酶活力达到最大值2.2944 U/mL，野生型20-7几丁质酶力比其它突变体菌株的酶活力几乎都要大，不同菌株的几丁质酶活力高峰出现的或早或晚。另一方面，野生型20-7在第6d产蛋白酶活力为2.6453 U/mL，为最大酶活力。突变体BN-7的蛋白酶活力在所有菌株中一直处于最低值。.采用hiTAIL-PCR的方法，扩增了T-DNA右边界的基因组DNA序列。插入位点基因由4535个碱基组成，插入位点位于第一个外显子内距基因起始密码子778 bp处。该基因编码637个氨基酸,在肉座菌目中相对保守，与冬虫夏草、绿僵菌、鞭毛藻丛赤壳菌、葡萄穗霉、尖孢镰刀菌和绿色木霉分别有76.44%、74.39%、65.63%、65.02%、64.73%和61.22%的相似性.这些序列都未有相关功能报道和研究.因此,我们将该基因命名PlPRG1（代表Paecilomyces lilacinus pathogenicity-related gene 1）。