烟粉虱唾液钙调磷酸酶、半胱氨酸蛋白酶和14-3-3蛋白功能研究

As a sap feeder insect, the whitefly Bemisia tabaci can secrete protein-rich saliva into leaf tissue and manipulate some of the natural defenses of plants. However, little has been know about the constituents and function of whitefly salivary secretions. Previously, we have identified 11 whitefly salivary proteins by mass spectrum analysis of the collected whitefly saliva and found that the overexpression of three salivary proteins (calcineurin, cysteine proteinase and 14-3-3 protein) in tobacco can significantly increase the survivability and fecundity of whiteflies on tobacco, suggesting they are potential whitefly salivaary effectors. This project aims to reveal how these 3 effectors manipulate plant defenses and benefit whitefly growth. First of all, polyclonal antibodies will be prepared for these 3 proteins. Next, whether these 3 proteins can be secreted into the host plant tissues during the process of whitefly feeding will be confirmed by immune-fluorescence and Western Blot. In order to reveal the possible function of these effectors, the expression level of plant defense genes will be analyzed in detail after the overexpression of these proteins in tobacco. Furthermore, the activation of various plant defense pathways will be analyzed. Then, yeast-2-hybrid and immunoprecipitation will be performed to find tobacco proteins with which the effectors interact. Potential interactions will be confirmed by co-IP assays. Together these data will reveal how these whitefly effectors modulate tobacco defenses. Knowledge of these genes will facilitate breeding for increased whitefly resistance.

作为刺吸式口器的害虫，烟粉虱在取食过程中会分泌唾液调控植物防御反应，可是目前关于烟粉虱唾液蛋白的功能还所知甚少。本实验室前期通过质谱分析从烟粉虱唾液中鉴定出了11个蛋白，在烟草中过表达其中3个唾液蛋白（钙调磷酸酶、半胱氨酸蛋白酶和14-3-3蛋白）可以显著提高烟粉虱在烟草上的存活率和产卵量。本课题旨在明确这3个烟粉虱唾液蛋白是如何调控植物防御反应并促进烟粉虱生长。首先制备抗体，应用免疫荧光技术确认这3个蛋白是否会在烟粉虱取食时分泌到寄主植物中及其组织分布。然后测定过表达相应蛋白后寄主植物基因表达谱和茉莉酸、水杨酸、活性氧、蛋白酶等防御反应，明确烟粉虱唾液效应蛋白如何调控植物防御。最后通过酵母双杂交等方法找出与这三个唾液效应因子互作的宿主植物蛋白，阐明这3个烟粉虱唾液蛋白调控植物防御反应的机制。明确烟粉虱唾液的作用机制后，就有可能设计相应的策略阻断唾液效应因子的作用，有效地控制烟粉虱的危害。

烟粉虱是刺吸式口器害虫，在取食过程中烟粉虱的唾液起着关键作用。由于烟粉虱个体微小，分析烟粉虱唾液功能非常困难，因此关于烟粉虱唾液的研究还很匮乏。本项目从烟粉虱唾液腺中找到了3个可以调控植物防御反应的关键效应因子（Bt56, 14-3-3和2477），我们发现这3个唾液效应因子均在烟粉虱唾液腺中高表达，并且可以提高烟粉虱在植物上的存活率和产卵量。实验表明，在植物中过表达Bt56蛋白提高了烟草对烟粉虱的适合度并激活了烟草的SA信号途径。与之相反的，沉默烟粉虱的Bt56基因降低了烟粉虱在植物上的存活和繁殖。沉默Bt56基因的烟粉虱不能进行正常的韧皮部取食，并丧失了激活植物SA信号途径的能力。通过蛋白质-蛋白质互作实验，我们发现烟草中的一个转录因子NTH202能够与Bt56蛋白互作。烟草的NTH202基因能够降低烟粉虱在烟草上的存活和繁殖，并抑制烟粉虱诱导的SA积累。我们也研究了唾液效应因子14-3-3和2477抑制植物抗虫反应的机制，找到了这两个效应因子在植物中的靶标蛋白。另外，我们发现一种烟粉虱传播的番茄黄曲叶病毒（TYLCV）在烟粉虱唾液腺中高效复制，促进病毒的传播。TYLCV侵染后，烟粉虱唾液腺中许多DNA合成相关基因的表达发生上调，例如增殖细胞核抗原（PCNA）。进一步研究发现TYLCV的复制相关蛋白（Rep）可以与烟粉虱PCNA发生互作，促进病毒复制。由于烟粉虱是世界性的重大害虫，深入了解烟粉虱调控宿主植物的关键基因及烟粉虱-植物互作机制后，可以找出更合适的靶标，设计相应的策略防控烟粉虱的危害。