基于线粒体蛋白组学研究二氢青蒿素抗肿瘤分子机制

二氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)是著名抗疟药物青蒿素类化合物的主要活性代谢体。研究显示DHA不但具有广泛的抗肿瘤作用，而且对正常细胞毒性小，具有不同于传统化疗药物的鲜明特点。本课题通过构建对DHA耐药的肿瘤细胞株，选取与DHA抗肿瘤关系最为密切的线粒体作为研究对象，采用先进的2D-DIGE和质谱技术检测亲本细胞和耐药细胞间、亲本细胞对照组与DHA处理组间以及耐药细胞对照组与DHA处理组间线粒体差异表达蛋白。进一步通过软件分析并结合以往研究，建立DHA抗肿瘤蛋白信号网络。选择可能对DHA抗肿瘤起关键作用的蛋白，构建其相应质粒及siRNA，并转染肿瘤细胞检测其作用，进而探索DHA的抗肿瘤靶点。这一研究不但有可能揭示DHA的抗肿瘤分子机制，解决青蒿素类化合物开发的瓶颈问题，而且能为其他化合物药理分子机制的揭示提供重要的方法学参考，具有重要的理论意义和应用价值。

青蒿素类化合物具有显著的抗肿瘤活性，但肿瘤细胞对其耐药的特征及机制知之甚少。本项目基于蛋白质组学技术结合现代分子药理学方法，探讨肿瘤细胞对青蒿素类化合物主要体内活性代谢体二氢青蒿素（DHA）的耐药特征及机制，并为深入理解该类化合物的抗肿瘤分子机制提供线索。通过逐步加大药物浓度的方法成功构建了对DHA耐受的HeLa/DHA细胞株，该细胞株并不高表达常见的多药耐药基因如BCRP、MRP1、LRP、MDR1；也不表达P-gp蛋白；常用化疗药物如Taxol、VP16、TPT、5-FU对亲本HeLa细胞和耐药的HeLa/DHA细胞具有类似的增殖抑制作用；阿霉素在两株细胞中的积累量一致。以上结果说明HeLa/DHA细胞株不具备多药耐药特征。之后我们采用全细胞蛋白组学和线粒体蛋白组学技术，分析了亲本HeLa细胞及耐药的HeLa/DHA细胞中差异表达蛋白质。在比较了2D-DIGE联合MALDI-TOF及液相联合质谱技术后，选用后者，并通过网络构建和对不同变化蛋白的比较，发现PARP7，即DJ-1蛋白在耐药细胞中显著高表达。采用免疫印迹和免疫荧光证实了蛋白组学的结论，这种高表达不仅体现在细胞水平，在裸鼠移植瘤中同样存在相同的现象。DJ-1敲除成功后DHA显著提高HeLa/DHA的诱导凋亡率和细胞增殖抑制；相反如在HeLa细胞中高表达DJ-1，则这些细胞对DHA产生耐受。进一步研究发现耐药株中DJ-1调控的两个基因catalase和GCLC的mRNA升高。HeLa细胞DHA处理后活性氧（ROS）随时间增加，而耐药株中基本不变。用双氧水处理，相比于亲本细胞，耐药株几乎不产生ROS。此外NAC预处理可部分逆转DHA引发的沉默DJ-1的HeLa/DHA细胞的增殖抑制和细胞凋亡。以上说明DJ-1的高表达使得HeLa/DHA耐药株具有更强的抵抗氧化应激能力，从而产生对DHA的耐受。这一项目不仅从全新的角度揭示了肿瘤细胞对青蒿素类化合物可能的耐药机制，也为该类化合物的抗肿瘤作用机制的深入研究提供了新的线索，并为其他类型化合物的相关研究提供了示范和借鉴。截止目前已经发表相关论文及综述8篇，其中5篇为SCI收录；参加高水平学术会议4次；与海内外高水平研究院校进行了交流合作并建立了良好的合作关系。项目的主要研究成果尚处于审稿阶段。