二氢青蒿酸生物合成青蒿素的酶催化反应与代谢调控研究

由二氢青蒿酸生物合成青蒿素仅是自动氧化反应，还是酶促反应，抑或二者兼而有之，至今尚无确切结论。根据前期实验结果，我们初步推论此途径应包括酶促反应和自动氧化反应，且以前者为主。本项目拟利用黄花蒿悬浮培养细胞及其酶系统，探索二氢青蒿酸生物合成青蒿素的酶催化反应与代谢调控。首先，以二氢青蒿酸为底物，利用黄花蒿悬浮培养细胞生物合成青蒿素，运用色谱和光谱技术分离和鉴定各中间体；其次，利用从黄花蒿悬浮培养细胞中获取的酶系对二氢青蒿酸及各相关中间体进行酶催化反应，进而确定从二氢青蒿酸到青蒿素的生物合成途径，并区分自动氧化产物及酶催化产物；最后，在酶活测试指导下，分离纯化二氢青蒿酸生物合成青蒿素过程中的关键酶，并运用谱学和蛋白质测序技术研究其氨基酸序列。本研究将首次从分子水平上为青蒿素生物合成途径提供科学证据，填补国内外该领域研究空白。研究结果对于确认二氢青蒿酸生物合成青蒿素的酶催化反应途径具有重要意义。

项目采用生物转化的方法研究青蒿素的生物合成途径。以青蒿酸、二青青蒿酸为底物，以黄花蒿悬浮细胞、长春花悬浮细胞、转基因西洋参冠瘿组织、杨桃悬浮细胞作为生物转化体系。以青蒿酸作为底物，共分离、鉴定了10个转化产物，包括4个新化合物；以二氢青蒿酸为底物进行转化产物，共分离、鉴定了10个转化产物，包括2个新化合物。分别考察了青蒿酸、二青青蒿酸的生物转化时效曲线。生物转化结果表明，二氢青蒿酸在黄花蒿细胞内可有效转化生成青蒿素，而青蒿酸却不能，表明二氢青蒿酸是青蒿素的直接前体。对比实验结果显示：二氢青蒿酸生物转化生成青蒿素的过程中涉及酶的参与。为了进一步验证该实验结果，作者采用了RT-PCR实验考察了关键酶的表达情况。研究结果显示，加入二氢青蒿酸可显著上调青蒿素生物合成途径中ADS、CYP71AV1及FPPS关键酶基因的表达，进而实现次生代谢产物青蒿素的积累。采用细胞转化法及体外酶转化法证明了二氢去氧青蒿素B为二氢青蒿酸合成青蒿素K及3-β-羟基二氢去氧青蒿素B（DHAA-9）的前体。本项目研究结果为青蒿素生物合成途径的诠释提供了新的科学资料。