二氢青蒿素抑制HIF-1α介导的多发性骨髓瘤细胞VEGF转录与表达的分子机制

青蒿素类药物抗肿瘤作用公认的机制认为与产生活性氧簇（ROS）攻击亚细胞膜系结构有关。本项目前期研究表明，二氢青蒿素能明显抑制低氧快速生长的肿瘤细胞VEGFmRNA转录及VEGF蛋白表达，选取多发性骨髓瘤细胞(MM RPMI8226)深入研究发现能使线粒体膜电位（ΔΨm）破坏并出现大量线粒体自噬。本项目拟以线粒体为受攻击的细胞器，明确证实二氢青蒿素激活低氧环境MM细胞自噬反应的始动因子，进一步从亚细胞、细胞、整体动物水平阐明二氢青蒿素抑制HIF-1α介导的MM 细胞VEGF转录与表达的分子机制，其研究内容包括：(1)二氢青蒿素损伤细胞器（线粒体）激活自噬反应；(2)激活的自噬相关蛋白在细胞质/细胞核/自噬泡中定位分析；(3)激活自噬通路阻止细胞核中HIF-1α积聚及对VEGF转录；(4)在整体动物证实诱导MM细胞自噬性凋亡。阐明青蒿素类药物抗肿瘤作用机制同时观察能否有效克服化疗药物耐药。

二氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）为青蒿素类药物在体内的主要活性代谢产物，本项目选取人多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）RPMI 8226细胞株作为主要研究对象，重点考察以下四个方面：1）二氢青蒿素抑制HIF-1α介导的多发性骨髓瘤细胞VEGF转录与表达的分子机制，我们在低氧培养的RPMI8226细胞观察到，DHA呈时间依赖性下调RPMI 8226细胞的VEGFmRNA和VEGF蛋白表达，能明显下调细胞核内HIF-1α的表达，通过共孵育自噬抑制剂3-MA出现回调HIF-1α的下调现象，提示DHA降低核内HIF-1α水平及抑制VEGF转录与表达可能与自噬有关。2）二氢青蒿素诱导多发性骨髓瘤细胞发生自噬反应的分子机制，DHA能明显诱导多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞发生自噬反应，DHA诱导的LC3-Ⅱ表达的增加是因为自噬通量的增加，而并非自噬体与溶酶体结合受阻导致的累积，DHA可诱导RPMI 8226细胞发生功能性自噬，并且通过这种途径特异性降解受损的线粒体。3）二氢青蒿素诱导肿瘤细胞发生自噬与活性氧（ROS）的过度产生有关，DHA可显著抑制RPMI 8226细胞内FHC和MnSOD的活性，反之，抑制细胞内ROS的水平可抑制DHA诱导的细胞自噬反应，由此证明DHA通过诱导产生过量的ROS而激活自噬反应。4）二氢青蒿素合用吡柔比星协同诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的作用机制，在SCID小鼠RPMI8226骨髓瘤移植动物模型中，单用二氢青蒿素50 mg•kg-1给药一个月，能靶向诱导荷瘤小鼠骨髓瘤细胞线粒体自噬，给药三个月后骨髓血管密度比生理盐水对照组明显减少；二氢青蒿素50 mg•kg-1与吡柔比星2.5 mg•kg-1合用有协同诱导骨髓瘤细胞凋亡作用；取低氧培养对数生长期RPMI8226骨髓瘤细胞分别经二氢青蒿素（20μM），吡柔比星（1.5μM）及两者联合处理6 h后，细胞内VEGFR2与VEGF蛋白表达均显著下调。体内外实验结果表明，二氢青蒿素抑制荷骨髓瘤小鼠骨髓组织血管新生，增强吡柔比星治疗效果。 二氢青蒿素合用吡柔比星协同诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的作用机制与细胞内ROS过度产生有关。