Myxoma 病毒蛋白Serp-1促进肝癌细胞Anoikis的作用及机制研究

The biological behaviors of tumor cells characterized by invasion and metastasis are always concerned for ages. Anoikis medically refers cells lose the ability of adhesion and then undergo apoptosis. Tumor cells are endowed to resistance to anoikis. Studies have shown that the clotting factor (FXa) and fibrinolytic factors (uPA) promoted invasion and metastasis of tumor cells and that the oxidative phosphorylation pathway (LDH, PDH, PDK), and mitochondrial respiratory chain products (ROS) are also closely related to tumor cell anoikis. Serp-1 protein derived from myxoma virus can directly inhibits FXa and uPA. To study the role of FXa and uPA in the liver tumor anoikis and explore if Serp-1 potentially promote anoikis through the mitochondrial metabolism and respiratory chain pathway, using shRNA technology and pDEST17 Gate way over-expression vector in our study to establish the stable liver cancer cell lines with FXa or uPA low and high expression to evaluate the levels of anoikis and the role of Serp-1 on anoikis in vitro. On the basis of previous experiments, LDH, PDH, PDK, and ROS inhibitors will be used to confirm the effect of oxidative phosphorylation and mitochondrial respiratory chain pathways on tumor cell anoikis. Through the use of severe combined immune defects (SCID) mice , SCID mice plus FXa or uPA gene knockout , and SCID mice injected with human peripheral blood mononuclear cells to establish three types of animal models to futher confirm whether Serp-1 can promote anoikis of liver tumor cells in vivo by inhibiting FXa, uPA, and modulation of immune cells.

肿瘤细胞浸润和转移的生物学行为始终是关注的交点。anoikis 指细胞失去了粘附而诱导凋亡。瘤细胞具有抗脱落凋亡的作用。研究表明FXa和uPA促进了肿瘤细胞的浸润转移。氧化磷酸化和线粒体呼吸链产物与肿瘤细胞脱落凋亡也密切相关。Serp－1是粘液瘤病毒来源的具有抑制FXa 和uPA功能的蛋白质。本研究拟采用shRNA技术和pDEST17过表达载体建立FXa，uPA低和高表达肝肿瘤细胞系，研究它们在肝肿瘤脱落凋亡中的作用，评价Serp－1的功能。在此基础上使用LDH,PDH,PDK 和ROS的抑制剂研究氧化磷酸化和线粒体呼吸链途径是否是Serp－1促进脱落凋亡的可能机制。通过使用重症免疫缺陷小鼠，和联合FXa或uPA基因敲除小鼠，和联合注射人体外周血单个核细胞建立三种瘤细胞转移的动物模型，在体内探索Serp－1是否通过抑制FXa，uPA和调节机体免疫细胞促进肝肿瘤细胞的脱落凋亡。

本课题组集中研究“Myxoma 病毒蛋白Serp-1促进肝癌细胞Anoikis的作用及机制”，已基本完成了课题的相关实验，已发表SCI论文1篇，一篇文章正在投稿中，通过该项目培养博士生1名，硕士生1名。研究结果表明：.1）FXa和uPA在肝肿瘤细胞系和人肝癌标本中都有表达。.Factor Xa 和uPA在人肝肿瘤细胞系HepG2、HepG3b、Huh7和PLC/PRF/5 中的基因水平和蛋白表达水平明显高于正常人肝细胞L02,且离巣悬浮的肿瘤细胞Factor Xa 和uPA的表达水平明显高于贴壁细胞,说明Factor Xa和uPA很可能在肝肿瘤细胞抗Anoikis中发挥作用,更重要的是在人肝癌细胞中也证实了Factor Xa 和uPA的表达。.2）肝肿瘤细胞系具有抗anoikis的特质.结果发现正常肝细胞从贴壁到悬浮的状态，24小时到48小时有60%-70%的细胞出现了离巣凋亡现象，即anoikis，而肝肿瘤细胞系特别是HepG2、HepG3b、PLC/PRF/5细胞即使在悬浮状态下也没有出现明显的离巣凋亡（约10-15%），具有抗anoikis的能力。.3）肝肿瘤细胞系抗anoikis的作用与caspase基因相关.通过PCR对离巣的肝肿瘤细胞系HepG2、HepG3b、Huh7、PLC/PRF/5.和正常人肝细胞L02检测caspase-1/3/8/9/10基因的表达，结果显示离巣后的肿瘤细胞caspase-1/3/8/9/10基因在不同的肿瘤细胞中相对于正常肝细胞出现了不同程度的表达下调，在Huh7细胞中以caspase-/8/9表达下调为著，在HepG3b和PLC/PRF/5中caspase-1/3/8/9/10基因表达均显著下调。.4）Serp-1 蛋白抑制肝肿瘤细胞在体内外的转移和生长.体外的transwell实验发现Serp-1能显著抑制肝脏肿瘤细胞HepG2、HepG3b、Huh7和PLC/PRF/5跨膜迁移运动，肿瘤活体影像示踪技术显示经腹腔注射Serp-1蛋白可以抑制HepG2肿瘤细胞的生长。.综合以上结果，我们可以利用Serp－1在凝血，纤溶，炎症、免疫中的调控作用，探索抑制肿瘤浸润转移的有效方。.