黄曲霉毒素解毒酶基因的克隆及外源分泌表达

黄曲霉毒素（AFT）对人和动物危害巨大。课题组在已完成国家自然科学基金项目中分离到一株粘细菌，其分泌的胞外酶对AFTB1的降解率达78%以上。分离纯化解毒酶蛋白经电泳显示分子量约为44kDa。本次申请拟将纯化后的粘细菌黄曲霉毒素解毒酶活性蛋白应用胰蛋白酶原位降解得到肽段混合物；用高效液相色谱法分离肽段，并采用Edman降解法测定3个10-15个氨基酸残基组成的特征肽段氨基酸序列；根据特征肽段氨基酸序列设计寡核苷酸引物，以粘细菌基因组DNA为模板进行end to end PCR扩增；通过对PCR产物序列分析得到黄曲霉毒素解毒酶全长基因，并构建解毒酶基因异源表达的毕赤酵母重组菌株。将重组菌用于高密度发酵培养，进行解毒酶基因表达及重组菌产酶分析。通过本研究将发现黄曲霉毒素解毒酶基因和得到自主知识产权的毕赤酵母重组菌，为黄曲霉毒素的降解提供理论依据，也将为此酶作为饲料添加剂的进一步应用奠定基础。

本项目对粘细菌黄曲霉毒素降解酶（MADE）的最佳发酵条件、分离纯化、酶学特性、特征肽段氨基酸序列、基因克隆等方面进行了研究，并探讨了降解酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的外源表达及最优表达条件。（1）经单因素试验得到最佳发酵产酶条件为：VY/2培养基未加入酵母粉前pH值为10，接种量20%，溶氧量60%，温度30℃，转速200r/min，发酵时间30h；（2）粘细菌发酵上清液乙醇沉淀粗酶经DEAE琼脂糖凝胶层析和分子筛层析后，得到表观分子量约为32kDa的活性蛋白组分；（3）研究发现MADE在pH值在5.0-7.0之间，温度在30-45℃之间有较好的酶活，Mg2+对酶活有促进作用，Zn2+是酶的抑制剂；（4）通过Edman降解法获得MADE蛋白N末端20个氨基酸序列，经ESI-Q-TOF2分析又获得该酶任意5个特征肽段氨基酸序列；（5）运用RACE方法得到了降解酶基因，编码基因全长1659bp，编码553个氨基酸；（6）将降解酶基因克隆到原核表达载体pET30a上，并转入大肠杆菌BL21中进行诱导表达，表达水平达到1 g/L，所表达的MADE对黄曲霉毒素的解毒活性大于1000U/ml，为原菌株粘细菌的14.29倍；（7）人工合成密码子优化基因，克隆到真核表达载体pPICZαA上，并电转化至毕赤酵母GS115中进行诱导表达，最佳诱导表达条件为：BMMY培养基pH值为4.0，甲醇浓度为1.5%，培养温度28℃，培养时间4d，表达水平达到2 g/L，所表达的MADE对黄曲霉毒素的解毒活性大于3000U/ml，为原菌株粘细菌的42.86倍。