基于PINK1/Parkin通路探讨小续命汤调控急性脑缺血再灌注后线粒体自噬的分子机制研究

We have reported that Xiao-Xu-Ming decoction (XXMD) could notably alleviate cerebral injury induced by cerebral ischemia and reperfusion in rats. In addition, the findings demonstrated that XXMD protected mitochondria from ischemic injury and inhibited apoptosis. The mitochondrial p53 pathway could be partially involved in the protective effects. Mitophagy is crucial for mitochondria mass and homeostasis. PINK1/Parkin mediated mitophagy play a crucial role in the removal of damaged mitochondria. The effects of XXMD on mitophagy and underlying mechanisms need be further tested and verified. The present study is aimed to evaluate the protective effects of XXMD on mitophagy in a spontaneously hypertensive rat model of cerebral ischemia and reperfusion injury and to explore the underlying mechanisms from PINK1/Parkin pathway. In all, our study will provide more new evidence for XXMD in treatment of cerebral ischemic disease.

我们前期研究证实，小续命汤可减轻脑缺血再灌注导致的脑损害，具有较好的神经保护作用。此外还发现，小续命汤治疗可明显保护脑缺血再灌注后线粒体的形态，抑制神经细胞凋亡，该作用可能与线粒体p53通路的激活有关。线粒体自噬可维持线粒体的质量和稳态。PINK1/Parkin介导的线粒体自噬降解受损线粒体的重要途径。小续命汤对脑缺血再灌注后线粒体自噬是否具有一定调控作用及PINK1/Parkin通路是否参与该调控作用，需要进一步阐明和全面的证据支持。本项目拟利用自发性高血压大鼠建立脑缺血损伤模型，从线粒体自噬结构和活性两方面，评估小续命汤对线粒体自噬的调控作用；从PINK1/Parkin信号通路探讨小续命汤调控线粒体自噬结构和活性的分子机制，进一步明确小续命汤的保护作用靶点，为小续命汤在脑缺血性疾病的应用提供科学依据。

首载于唐代孙思邈的中医经方—小续命汤临床应用治疗脑卒中患者临床疗效确切，进一步研究神经保护作用机制十分必要。在前期研究的基础上，我们通过建立急性脑缺血再灌注损伤模型，发现大脑中动脉闭塞90分钟不同时间点再灌注均可导致大脑中动脉供血区发生脑损伤和线粒体自噬的发生。结果显示线粒体自噬相关蛋白LC3B、Beclin1、LAMP-1的峰值表达为再灌注24小时，透射电镜及免疫荧光染色证实LC3B主要定位在神经元中，在星形胶质细胞表达水平较低，血管内皮细胞表达水平更低。再灌注24h后，线粒体外膜PINK1明显增加，Parkin/p62线粒体易位增加。这些发现表明PINK1/Parkin/p62信号通路参与了脑缺血再灌注这一病理生理过程。我们设立小续命汤不同剂量组，确定小续命汤对脑缺血再灌注大鼠具有神经保护作用，可上调缺血半暗带皮层BDNF、GDNF表达，60g/kg/d为最佳疗效剂量。随后我们设立不同的干预方法，发现小续命汤最优剂量或环孢素A治疗可显著减轻大脑中动脉闭塞导致大鼠的神经功能缺损及细胞缺血再灌注损伤，改善线粒体结构和功能，明显下调线粒体自噬发生和减少脑缺血再灌注诱导的LC3B、Beclin1、Lamp1表达。研究结果还证实小续命汤可能通过线粒体Parkin、p62蛋白表达水平发挥神经保护作用，进而抑制线粒体自噬。自噬抑制剂3MA联合小续命汤可减少脑梗塞面积形成，抑制自噬的发生。通过本研究，我们初步证实小续命汤的神经保护作用及多靶点作用机制，但仍需要开展更深入的研究如延长脑缺血再灌注时间、加大样本量等进一步研究其神经保护作用机制及毒副作用，为其防治脑卒中的广泛应用提供充分可靠的科学依据。