颞叶癫痫异常神经发生中HIF-1和神经干细胞作用的实验研究

探索癫痫形成的机制和理想治愈癫痫的方法倍受关注。已知海马齿状回颗粒下区的内源性神经干细胞参与癫痫异常神经发生，且植入外源性神经干细胞能抑制癫痫发作，但在癫痫环境中内外源性神经干细胞如何受调控参与或干预异常神经发生尚不清。本项目欲论证假说缺氧诱导因子（HIF-1）调控内外源性神经干细胞参与或影响癫痫异常神经发生。拟通过颞叶癫痫大鼠模型，用BrdU在体标记内源性神经干细胞，用GFP和SPIO双重标记外源性神经干细胞，在整体、组织和细胞水平用MRI、电生理、免疫组化、电镜等技术观察癫痫神经干细胞迁移分化、突触形成、神经网络等，与测定海马区HIF-1α表达对比研究，来判断HIF-1和内外源性神经干细胞在癫痫异常神经发生的作用。用拓扑替康抑制HIF-1α表达进一步论证HIF-1与异常神经发生的相关性。在此基础上研究移植神经干细胞的生存率和其疗效是否受HIF-1调控影响，为治疗癫痫提供新的研究思路。

目前，癫痫形成和发展的机制仍不清楚，至今也没有理想的治疗手段，这两方面的突破长期以来都是癫痫研究的重点和难点。缺氧诱导因子HIF-1α调节神经发生的作用越来越得到肯定，急性癫痫时期神经发生的增加以及慢性癫痫神经发生的急剧下降与海马内HIF-1α的表达可能存在相关性，但是至今未见HIF-1α对癫痫神经发生作用的相关研究报道。本研究拟采用氯化锂-匹鲁卡品癫痫模型，利用免疫组织化学技术和原位杂交技术测定急性癫痫和慢性癫痫时期HIF-1α的表达，利用BrdU、BrdU/NeuN免疫荧光染色在体标记海马齿状回神经干细胞观察急、慢性癫痫时期的神经干细胞增殖情况，由此判断HIF-1α表达与癫痫各期海马齿状回神经发生之间是否存在相关性。我们研究发现在急性癫痫状态下，HIF-1α在海马齿状回及CA3区呈较高的表达状态，且利用HIF-1α抑制剂—2-甲氧雌二醇进行实验干预，发现高表达的HIF-1α受到明显抑制。我们通过后续实验观察其对急性癫痫海马齿状回神经干细胞增殖，迁移和分化的影响，同时评估其对癫痫是否存在治疗作用。实验研究发现急性颞叶癫痫大鼠海马区域神经元发生丢失，而使用2-甲氧雌二醇后，大鼠海马区域神经元丢失减少，并且浓度较高组（1.0mg/kg-2.5mg/kg）神经元保护效果更好；在慢性癫痫模型海马各区域同样存在神经元丢失，但丢失达到一定程度后不再进行性加重，存在丢失的“稳定期”，抑制剂干预以后神经丢失减少，并且提前达到丢失“稳定期”；癫痫持续状态发生后海马齿状回颗粒细胞下区神经发生明显增加，体现在颗粒细胞数目增多，部分发生异位迁移，而干预后抑制效果明显，这也为癫痫药物干预治疗提供新思路；本课题组关注干细胞方面的研究，在神经干细胞、骨髓间充质干细胞、肿瘤干细胞的分离、提取和鉴定方面有一定的研究基础，这也为后续展开外源性干细胞干预治疗癫痫疾病提供了技术支持。