FTH-EGFP标记移植神经干细胞在癫痫发生和HIF-1α抑制下的作用研究

Previous studies demonstrated neural stem cells (NSCs) or GABAergic neurons transplantation is a powerful approach to restrain seizures, while the precise mechanisms underlying cell transplantation strategies mediated seizure suppression are yet to be clear known. The promise of cell transplantation therapy for restraining spontaneous recurrent seizures (SRSs）in TLE may stem from their ability to migrate and produce significant numbers of GABAergic neurons synthesizing the inhibitory neurotransmitter GABA. Hypoxia can lead to neuronal cell death and alterations in GABA receptor expression, and the same mechanisms were also found in epilepsy. Recent studies in our laboratory shows a substantial reduction in neuron loss and abnormal up-regulated neurogenesis induced by seizures after application of HIF-1 α inhibitor. Therefore, we hypothesize that cell therapy can supplement GABAergic neurons for rebuilding the damaged inhibitory function in hippocampus. And HIF-1α inhibitor can improve therapeutic effects in the treatment of TLE as well as avoid the malfunctioning in regenerated GABA receptors, as using HIF-1α inhibitor can abort the epileptogenic pathology process. This project aims at the mechanisms of cell therapy in restraining epileptogenesis during early-life or adult with and without the inhibition of HIF-1, studying the morphological and functional evolution of grafted NSCs or GABA progenitors labeled with MRI-optical dual-report gene. And further elaborate the specific mechanisms underlying cell therapy, provide a novel therapeutic target for epilepsy treatment.

研究证实外源性神经干细胞或GABA能前体细胞对颞叶癫痫发作具有抑制作用，其确切机制尚不详，提示与分化补充GABA能中间神经元形成抑制性突触，建立新抑制性神经网络有关。前期研究显示癫痫发生致大量神经元丢失及GABA受体数量和亚基结构异常，应用HIF-1α抑制剂后神经元的丢失和海马齿状回颗粒细胞下区异常神经发生明显减少。因此我们假设：植入神经干细胞可增加GABA能中间神经元，建立新的抑制性神经网络；并提出HIF-1α抑制可限制癫痫发生中海马自身的病理发展，辅助提高外源性神经干细胞抗癫痫作用及避免新生的GABA受体的再损害。拟用研发的磁共振光学报告基因（FTH-EGFP）标记神经干细胞或GABA能前体细胞，分别在成幼年癫痫大鼠模型上研究标记的神经干细胞或GABA能前体细胞在癫痫发生或HIF-1α抑制下的结构变化和功能作用；进一步阐明神经干细胞治疗成幼年癫痫的作用机制，为治疗癫痫提供新策略。

目前，癫痫形成及发病具体机制尚不明确，这是研究癫痫的难点，也是制约抗癫痫药物开发的重要原因之一。缺氧诱导因子HIF-1α调节神经发生的作用越来越得到肯定，我们团队之前对此也进行了较深入研究，但是其调节的具体机制仍不十分明确。众多文献报道Notch信号通路对调节炎性反应、调节神经发生等具有重要作用，而有关Notch信号通路对癫痫神经发生调控机制的研究尚未见报道。本研究拟采用氯化锂-匹鲁卡品癫痫急性模型，采用Western Blot、PCR、免疫组织化学、免疫荧光染色、免疫共沉淀等技术，观察急性期癫痫大鼠海马区HIF-1α和Notch信号通路对炎性反应、神经干细胞增殖分化、神经元数量的调节作用，由此进一步探讨急性癫痫的神经发生机制。我们的研究发现，在急性癫痫状态下，HIF-1α和Notch信号通路被激活，HIF-1α、Jagged1、Notch1、NICD和Hes1等蛋白表达增高，TNF-α、IL-1β、IL-6和NF-kB等炎性因子表达增高，免疫荧光及免疫组化显示Iba1阳性小胶质细胞数量增多，BrdU标记的神经干细胞增殖数量增多，神经干细胞分化为BrdU/NeuN标记的阳性神经元和BrdU/GFAP标记的阳性神经胶质细胞较正常对照组增多，神经元丢失和凋亡明显；癫痫急性期分别注射HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇（2ME2）和Notch信号通路抑制剂γ-分泌酶抑制剂（DAPT）后，HIF-1α、Jagged1、Notch1、NICD和Hes1等蛋白表达明显减低，TNF-α, IL-1β、IL-6和NF-kB等炎性因子表达明显减低，小胶质细胞数量减少，神经干细胞增殖被抑制，神经干细胞分化的神经元较癫痫组增多，分化的神经胶质细胞较癫痫组减少。另外，研究发现注射HIF-1α抑制剂后， Notch信号通路相关蛋白（NICD及下游基因Hes1）的表达及转录水平也受到抑制，免疫共沉淀及免疫荧光结果显示HIF-1α通过与NICD物理结合调节Notch信号通路。我们研究结果表明，HIF-1α的激活能通过Notch信号通路对癫痫急性期炎性反应、神经干细胞增殖、分化及神经元丢失、凋亡进行调节，进一步加重急性癫痫的疾病过程。该研究结论可能为癫痫药物干预治疗提供新思路。