鸭大肠杆菌marA和acrB单基因缺失株的构建与多重耐药的调控机制

利用Red同源重组和位点特异性重组技术，分别敲除鸭大肠杆菌标准株和诱导耐药株marA、acrB基因，构建相应的marA、acrB单基因缺失株，经过噬菌体转导将标准菌基因缺失株中的缺失突变转导到分离多重耐药鸭大肠杆菌中，获得分离菌marA和acrB单基因缺失株。比较诱导菌或分离菌及其相应基因缺失株、标准菌基因缺失株及其基因缺失株诱导耐药突变体的主动外排基因AcrAB-TolC、调节基因marA的mRNA表达水平、外膜蛋白表达量及多重耐药表型，反向阐明鸭大肠杆菌主动外排作用、膜通透性降低、ESBLs基因间的相互关系及多重耐药的调控机制，创新建立符合动物源病原菌调节基因、耐药基因缺失株构建的分子生物学方法，为开展多种调节或耐药基因的同时敲除，全面研究细菌多重耐药的调控机制及多种耐药机制间的相互关系提供基础，为寻找潜在的抗菌作用靶点、有效防控多重耐药鸭大肠杆菌感染提供新的思路和理论依据。

按计划完成鸭大肠杆菌marA、acrB基因缺失株构建、主要耐药机制相互关系及MDR调控机制研究。用带kan及marA同源臂的线性靶DNA片段（1.6kb），通过Red同源重组和位点特异性重组，成功构建O73 marA单基因缺失株；制备长同源臂（2.5kb），也成功敲除marA 基因。以带有kan及acrB同源臂的靶DNA（1.7 kb），同法构建出acrB单基因缺失株。经P1噬菌体转导，分别获得分离菌marA和acrB缺失株。创新建立的基因缺失株构建方法，为多调节或耐药基因的同时敲除，全面研究MDR调控机制及MDR机制间的相互关系奠定了良好基础。. 比较了标准、诱导或分离菌及相应基因缺失株多个外排、调节基因的mRNA表达水平、Omp表达量及MDR表型。QRT-PCR测定显示，分离菌耐药程度、耐药谱与acrA、acrB的表达密切相关，而与acrE、acrF、mdtA 表达并不密切相关，acrD表达与对氨基糖苷类的耐药程度明显相关。耐药谱广和高水平耐药菌株marA、 soxS表达量高，但robA的表达量低于对照菌。分离菌敲除marA 后，6种外排基因的表达量降低1.8-2.8倍，而敲除acrB ，marA 、SoxS、RobA表达无明显变化，5种外排基因mRNA的表达增加。. Omp测定表明：Omp表达降低或缺失亦在MDR中具有作用，以OmpF、OmpA缺失和OmpC表达量减少为主。敲除marA、acrB，OmpC表达量升高，反向表明Omp表达受marA负性调控。O73敲除marA，庆大霉素、头孢噻呋、氟苯尼考、恩若沙星、多西环素的MIC下降8-16倍；敲除acrB，5药的MIC亦显著下降。O73敲除marA、acrB后, 经5种药物诱导30-40代，均不出现MDR。这从mRNA表达、表型反向证明：acrB在MDR中有重要作用，marA对MDR起正向调控作用。. 试验证明：分离MDR菌中耐三代头孢者存在ESBL、AmpC酶，耐利福平者存在rpoB突变，还证明耐喹乙醇、多西环素者存在oqxAB多药外排机制及四环素外排机制、核糖体蛋白保护机制，创新证明oqxAB多药外排也受marA的调控,揭示鸭大肠杆菌MDR表型是主动外排机制、外膜通透性改变、特异性机制共同作用的结果。本研究为有效防控鸭大肠杆菌感染提供了重要的新思路和理论依据。