多基因修饰iPS细胞分化为类β细胞机制研究

诱导多能干细胞 (iPS)在遗传学、全基因表达谱及多向分化潜能方面与胚胎干细胞（ESCs）极其相似，是细胞治疗和组织工程中最具前景的种子细胞之一。PDX-1、MafA 和NeuroD基因在胰腺发育及胰岛素基因表达过程中起着关键性的调节作用。在前期成功将鼠骨髓间充质干细胞重编程获得iPS细胞并发现其具有多向分化潜能的基础上，我们拟运用转基因技术将PDX-1、MafA 和NeuroD基因以不同组合方式分别导入iPS细胞，定向诱导其分化为类β细胞，通过对不同分化时期的类β细胞的特性因子、功能基因、蛋白表达检测对比，并进一步移植到糖尿病动物模型体内，观察其在糖尿病的体内环境下定植分化、功能基因及蛋白表达情况，以此来研究多基因修饰在iPS细胞向类β细胞定向分化过程中的作用机制,为最终获得足够量的胰岛β样细胞用于自体移植治疗糖尿病提供理论依据。

目的 胰岛素转录关键调控基因PDX-1、 NeuroD1及MafA转染小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)和小鼠诱导多能干细胞(iPSCs)后定向分化为胰岛素分泌细胞，探索体外基因转染制备胰岛素分泌细胞用于移植治疗1型糖尿病的可行性。.方法 .(1) 全基因合成小鼠PDX-1、NeuroD1及MafA基因编码区域并制备重组腺病毒Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad–mNeuroD-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP。(2) 、小鼠Oct4、Sox2、Klf4及cMyc经Tet-On慢病毒系统转导小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。通过形态学鉴定，干性基因检测，体内外三胚层分化等实验筛选鉴定iPSCs。(3)、三基因转染mBMSCs及小鼠iPSCs。通过RT-PCR、免疫荧光及ELISA检测转染细胞的胰岛素分泌。(4)、三基因转染的小鼠iPSCs定向分化为胰岛素分泌细胞后，移植到糖尿病小鼠模型肝脏，免疫组化检测其胰岛素的表达；空腹血糖监测检测其在糖尿病小鼠体内的功能发挥。.结果 .（1）、LV-ef1a-Hygromicin-TRE-Oct4/Sox2/Klf4/cMyc转染MEFs后，成功获取iPSCs，能形成边缘光整的致密克隆；表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1；在体内外能分化为三胚层组织。（2）、三基因转染的mBMSCs及小鼠iPSCs能分化为胰岛素分泌细胞，RT-PCR结果显示其胰岛β细胞功能基因的表达与小鼠胰岛β细胞株MIN6类似；免疫荧光检测见细胞胞浆内有胰岛素合成；ELISA检测结果显示细胞对不同浓度的葡萄糖有较好的反应性。（3）、三基因转染的小鼠iPSCs定向分化为胰岛素分泌细胞后移植到糖尿病小鼠肝脏，免疫组化发现移植细胞胞浆内表达胰岛素蛋白；空腹血糖监测显示移植细胞能够控制糖尿病小鼠的高血糖。.结论 .（1）、LV-ef1a-Hygromicin-TRE-Oct4/Sox2/Klf4/cMyc能成功将MEFs重编程为iPS细胞。（2）、胰岛素转录关键调控基因PDX-1、NeuroD1和MafA三者能协同作用，促进mBMSCs及小鼠iPSCs定向分化为具有显著的胰岛素合成和分泌能力的胰岛素分泌细胞。（3）、胰岛素转录关键调控基因修饰的小鼠iPSCs移植体内能发挥一定的治疗作用，有希望用于治疗1型糖尿病