猴皮肤成纤维细胞再程序化为诱导性多功能干（iPS）细胞重建自体眼表的研究

干细胞替代治疗是角膜缘干细胞损伤眼表疾病的根本解决途径，但受限于免疫排斥和伦理法律问题。诱导性多功能干(iPS)细胞是干细胞研究中的最新突破性进展，为眼表疾病提供了具有自身遗传背景的种子细胞，但其治疗功能尚不清楚，筛选策略有待优化，细胞内重新编程过程也不明了。本研究通过向细胞内转入关键性转录因子，把恒河猴皮肤成纤维细胞再程序化为iPS细胞。细胞筛选策略改进了目前的药物筛选，率先采用启动子筛选：预先在成纤维细胞内基因打靶敲入Pax6启动子P0-GFP融合基因。重塑为iPS后，细胞内特异性Pax6基因与启动子结合激活GFP，分选出阳性细胞。iPS细胞克隆扩增修复自体恒河猴角膜碱烧伤模型，术后进行动态的分子病理技术检测，观察修复效果，Pax6信号变化，细胞功能和分化程度。本研究优化了目前的iPS细胞筛选策略，从进化角度阐明iPS细胞内部的重新编程过程，有望成为治疗角膜缘干细胞损伤眼表疾病的新途径

本课题《猴皮肤成纤维细胞再程序化为诱导性多功能干（iPS）细胞重建自体眼表的研究》在国家自然科学基金/青年基金的资助下，在体细胞再程序化重建眼表以及角膜缘干细胞的特性研究方面进行了相关的研究工作，按照预期研究计划顺利进行并成功结题。研究工作不仅严格按照课题设计按时进展，而且紧密结合国际干细胞研究发展最新前沿，进行了拓展性研究。(1)在体外培养恒河猴皮肤成纤维细胞，通过预先在成纤维细胞内基因打靶敲入Pax6启动子P0-GFP融合基因，采用基因打靶技术，把启动子P0-GFP融合基因定点敲入（knock-in）沉默的猴成纤维细胞，高效分选出阳性细胞。(2)包装携带四种转录因子基因Oct3/4，Sox2，c-Myc，Klf4的逆转录病毒并使其感染恒河猴皮肤成纤维细胞，培养分选iPS细胞后在形态学、增殖能力、成瘤性、恒河猴胚胎干细胞（ES）特异性表面抗原的表达、内源性关键基因表达等方面证实皮肤干细胞具有重编程能力，可以在微环境的影响下重编程为不同组织来源的体细胞。(3)用经典的显微操作切除角膜缘干细胞联合0.25N的氢氧化钠碱烧伤，成功制作恒河猴角膜损伤模型。在眼表炎症稳定后进行组织重建。在眼表的微环境影响下，2周后，皮肤干细胞逐渐丧失皮肤细胞的特性，而重编程为结膜上皮样细胞。在移植术前，构建在羊膜上的皮肤干细胞，不表达结膜上皮细胞特异性抗体粘蛋白4（Mucin 4）和角蛋白4（keratin 4），在结膜移植术后2周，植片上的皮肤干细胞出现了粘蛋白4（Mucin 4）和角蛋白4（keratin 4）阳性表达，而β1 Integrin的表达则减弱。由皮肤成纤维细胞再程序化生成的iPS细胞克隆扩增成功修复恒河猴角结膜碱烧伤模型。(4)同时我们紧跟国内外同类研究工作取得的新进展，并对角膜缘干细胞的生物学特性进行了系统研究，发现Tcf4/Wnt信号通路可以维持角膜缘干细胞的低分化状态和高增殖能力，并且对于促进角膜创伤的修复起着重要作用。在青年基金资助课题的基础上，申请人的课题《Tcf4/Wnt信号系统调控皮肤细胞重编程重建角膜上皮的研究》已获得2012年度国家自然科学基金/青年-面上延续项目的资助，项目编号：81270013，71万。