以ABCA1为靶点防治动脉粥样硬化的新机制—ABCA1作为膜受体介导抗炎的新功能

(1)利用多种巨噬细胞模型，观察apoA1对LPS诱导的炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达的影响；利用siRNA干扰等技术观察apoA1处理后ABCA1、CDC42、PKA、ROK、STAT3和TTP表达和活性变化及对抗炎作用的影响；(2)构建ABCA1及相关突变体重组质粒，转染BHK细胞，采用免疫共沉淀等技术观察apoA1处理前后ABCA1与CDC42复合物的活性变化及对PKA/ROK/STAT3/TTP抗炎途径的影响，证实ABCA1作为CDC42相关膜受体介导抗炎并初步确定相关的结构域；本项目有望阐明ABCA1作为膜受体介导抗炎的直接效应和关键信号途径，发现apoA1/ABCA1结合后对胞内抗炎信号途径的调控规律，揭示ABCA1作为膜受体介导apoA1抗炎的结构基础，为以ABCA1为靶点防治动脉粥样硬化等慢性炎症疾病提供新的实验依据。

本项目主要从体内和体内两方面观察ABCA1作为膜受体介导抗炎的效应和分子机制：①观察HDL及其不同成分对LPS诱导THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞炎症因子表达的影响，并观察apoA-I调节巨噬细胞炎症反应的作用方式，结果发现：HDL和apoA-I预处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞3h后，LPS诱导的炎症因子TNF-α、IL-1β、MCP-1、IFN-γ和IL-6的表达明显减少，COX-2的表达无明显变化；HDL的其他成分apoB、PC和CHO对LPS诱导的THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞炎症因子表达无明显影响。ApoA-I预处理人外周血巨噬细胞3h后显著降低LPS诱导的TNF-α的表达。apoA-I并不明显影响LPS诱导THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的TNF-α启动子活性、p-IkBα和核内p65 NF-kB表达的水平。Act D终止转录后，apoA-I预处理明显降低不同时间点LPS诱导的炎症因子TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6的mRNA表达量，提示其促进了炎症因子的mRNA降解。②探讨apoA-I抑制LPS诱导巨噬细胞炎症反应的细胞内分子机制，结果发现：apoA-I明显上调LPS刺激下THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞和人外周血巨噬细胞TTP的表达，对HuR的表达没有明显影响；TTP siRNA下调THP-1巨噬细胞TTP的表达，并明显抑制apoA-I下调炎症因子表达和促进炎症因子mRNA降解的作用。RNA-EMSA结果显示，apoA-I促进THP-1巨噬细胞内蛋白质与ARE探针形成复合物，加入TTP抗体形成supershift带。ApoA-I迅速促进THP-1巨噬细胞JAK2和STAT3磷酸化，核内STAT3表达增加，STAT1和STAT6的磷酸化不受影响；AG490和STAT3 siRNA抑制JAK2、STAT3磷酸化，并明显抑制apoA-I对TTP表达的上调作用。ABCA1 siRNA下调ABCA1的表达，并明显抑制apoA-I对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞STAT3磷酸化和TTP表达的上调作用，也抑制了apoA-I促进TNF-α mRNA降解的效应。③以apoE基因敲除（apoE-KO）小鼠为研究对象，观察过表达人apoA-I对LPS诱导apoE-KO小鼠动脉粥样硬化（As）病变、血管壁巨噬细胞浸润和炎症因子表达的影响，并在体内探讨其相关分子机制: