受体型蛋白酪氨酸磷酸酶κ的N-糖链β1,6分支对其酪氨酸磷酸酶活性影响的分子机制及生物学意义研究

RPTPκ是高度糖基化的跨膜糖蛋白。RPTPκ具有酪氨酸磷酸酶活性并参与多条信号转导通路，发挥拮抗蛋白酪氨酸激酶作用。已有研究报道RPTPs形成二聚体后磷酸酶活性下降，胞外段在其二聚体形成过程中起关键作用，而N-糖链集中存在于其胞外段。我们的研究结果表明：GnT-V介导的N-糖链β1,6分支结构增加可显著下调RPTPκ的酪氨酸磷酸酶活性，进而影响下游的信号通路，但其中分子机制尚未阐明。综上结果，GnT-V介导的N-糖基化抑制RPTPκ酪氨酸磷酸酶活性的机制可能由RPTPκ发生同源二聚化所致。本项目通过调控GnTV表达引起RPTPκ胞外段N-糖链β1,6分支结构变化，观察细胞外Galectin-3与RPTPκ结合情况、RPTPκ在膜上潴留程度、RPTPκ二聚化程度、RPTPκ酶活性、下游信号转导以及细胞生物学行为变化等，从而阐明RPTPκN-糖基化变化对其酪氨酸磷酸酶信号系统影响的分子机制。

在过表达GnT-V 引起肿瘤侵袭转移过程中，GnT-V的底物发挥重要作用。RPTPκ和RPTPρ是RPTPs家族中RPTPμ亚家族成员，都是单次跨膜糖蛋白。RPTPκ胞内段含有磷酸酶活性区，能催化一些重要的底物分子（如β-catenin, EGFR）去磷酸化。为了研究GnT-V 对RPTPκ功能的影响，我们首先构建了无GnT-V 活性的GnT-V 突变体ΔcGnT-V 质粒，然后将野生型wtGnT-V、突变型ΔcGnT-V 质粒和空载体分别转入人肝癌SMMC-7721 细胞中。结果表明过表达GnT-V 提高EGFR 酪氨酸磷酸化水平，并提高EGFR 下游信号分子FAK、AKT、ERK的磷酸化水平。结果表明RPTPκ N 糖链β1,6 分支的增加降低其对EGFR 的去磷酸化作用，进而影响下游的信号。我们还研究了GnT-V对RPTPρ的N-聚糖异常修饰及其引起的生物学效应。我们构建了GnT-V稳转细胞株GnT-V-7721、GnT-V- HT29及空质粒对照株Mock-7721, and Mock-HT29。分别使用凝集素IP、免疫沉淀、凝集素印迹的方法发现过表达GnT-V使PTPRT的蛋白量及其N-聚糖三、四天线增加,多方面鉴定PTPRT是GnT-V的底物。用生物素标记细胞膜表面蛋白质并进行不同时间的培养，发现GnT-V-7721细胞中PTPRT在6小时内滞留量明显高于对照细胞，提示PTPRT可能存在二聚化。使用交联剂BS3对细胞表面进行交联，结果发现PTPRT在GnT-V过表达细胞中的二聚化水平显著高于Mock细胞。使用生物素标记细胞表面蛋白质，发现过表达GnT-V可以增加细胞膜上galectin-3的蛋白质水平，galectin-3与PTPR的共定位增加。阐明GnT-V通过增加galectin-3与PTPRT的结合起到促进PTPRT的二聚化作用。我们进一步探索PTPRT的二聚化增加对其信号途径的影响。RPTPs的二聚化可以抑制其磷酸酶活性。PTPRT可以催化信号转导与转录激活因子3(STAT3)pY705的去磷酸化。我们研究结果表明pY705 STAT3可能参与了GnT-V促进的细胞迁移。研究结果为进一步揭示GnT-V在肿瘤发生中的作用机制提供线索，将为降低恶性肿瘤的侵袭性甚至逆转肿瘤的发生提供一个新的治疗靶点和思路。