N-聚糖对胶质瘤中RPTPμ翻译后剪切及其介导的信号通路影响的分子机制研究

Receptor protein tyrosine phosphatases μ(RPTPμ) is a kind of transmembrane glycoprotein which has both catalytic tyrosine phosphatase domains in their intracellular segments and extracellular segments capable of mediating cell-cell adhesion.Receptor protein tyrosine phosphatases(RPTPs) can antagonize RTK signaling, promote cell-cell connection and thereby inhibit cell migration. RPTPμ is shown to be post-translationally regulated during tumorigenesis by proteolysis. It is found that PTPμ cleavage to promotes GBM cell migration suggesting that PTPμ cleavage promotes tumorigenesis. Our studies indicated that the cleavage of RPTPμ had close relationship to its β1,6-GlcNAc branched of N-glycan structure.The abnormal N-glycosylation of RPTPμ is supposed to be the main reason which mediate the GBM cell migration and dispersal.This project aims to elucidate the influences of varied N-glycosylations of RPTPμ by N-acetylglucosaminyltransferaseV (GnT-V) on the tumor migration regulation and the molecular mechenism involved. Detailed experimental procedures involved modulating the N-glycosylation degree of RPTPμ, investigating the protease cleavage degrees of RPTPμ and the destinations of the cleaved intracellular and extracellular segments, exploring the influences on the downstream signal transduction pathway and effector molecules, establishing the GBM cell nude mice model and studying whether inhibition or modulation of N-glycosylation of RPTPμ could reverse the malignant behavior. This project is expected to provide new therapeutic strategies for treating malignant Glioblastoma multiforme.

受体型酪氨酸磷酸酶μ(RPTPμ)是一种既参与细胞-细胞间嗜同性粘着、又具有酪氨酸磷酸酶活性的双功能跨膜糖蛋白。能够拮抗蛋白酪氨酸激酶，稳定细胞间连接、抑制细胞迁移而发挥抑癌因子作用。最近研究发现RPTPμ在胶质瘤细胞中极易发生翻译后剪切，被蛋白酶切割，从而引发胶质瘤细胞的侵袭迁移。本课题组研究发现胶质瘤细胞中RPTPμ的剪切与其N-聚糖的GlcNAcβ1,6 分支结构有极其密切的关系。本项目旨在通过N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V（GnT-V）调控RPTPμ的N-聚糖的分支数大小，观察RPTPμ被蛋白酶剪切程度及剪切后脱落的胞内段去向及功能，阐明RPTPμ的N-聚糖调控胶质瘤细胞侵袭迁移相关的信号通路和效应分子。并建立荷人胶质瘤细胞U87-GnT-V、LN229-GnT-V的裸鼠肿瘤模型，用N-聚糖抑制剂对裸鼠肿瘤进行人癌实验性治疗，以期为临床侵袭性极强的恶性胶质瘤提供新的治疗策略和手段。

目前对于恶性胶质细胞瘤最大的难点和挑战就是如何控制癌细胞的侵袭扩散，所以,亟需阐明神经胶质瘤细胞的侵袭迁移的分子机制。本论文旨在通过对PTP μ的N-聚糖的糖链类型与PTP μ的剪切之间的相关性研究，来揭示PTP μ的N-聚糖分支结构改变对胶质瘤细胞粘着斑形成及侵袭迁移行为的影响，以期为遏制临床上侵袭性极强的胶质瘤提供新的治疗策略和手段。我们采用了免疫组化的方法对60例病人脑胶质瘤组织及17例癌旁组织的GnT-V及PTP μ的表达量进行检测，结果显示，人脑神经胶质瘤组织中GnT-V的表达量高于癌旁组织，相反，人脑神经胶质瘤中PTP μ的表达量稍低于癌旁组织。提示GnT-V与人脑胶质瘤组织呈现正相关。建立了GnT-V过表达的人脑神经胶质瘤稳转细胞系。证明了PTP μ N-聚糖是GnT-V的底物。随即通过IP方法检测过表达GnT-V后PTP μ在神经胶质瘤细胞中的剪切状态。发现GnT-V-U87的细胞内，PTP μ的小片段明显高于Mock-U87组，而全长PTP μ的量高于Mock组。PTP μ胞内段具有酪氨酸磷酸酶的活性部位，我们通过体外酪氨酸酶活性测定实验证实了过表达GnT-V后，其酪氨酸磷酸酶的活性降低。Western blot结果显示,过表达GnT-V组细胞的PKC-P和PLCγ1-P的量都显著的增加。进一步研究了GnT-V催化PTP μ的β1,6 GlcNAc分支的增加对胶质瘤细胞迁移能力的影响，过表达GnT-V组的细胞迁移率升高。随即我们通过共聚焦对细胞迁移的重要始动因素—黏着斑的形成进行了观察。在GnT-V-U138、GnT-A172的细胞膜附近的FAK 及FAKpY397 与桩蛋白Paxillin有更显著的共定位，黏着斑的数量更多。说明过表达GnT-V后胶质瘤细胞募集这些信号形成黏着斑促使细胞迁移。同时建立了裸鼠肿瘤模型，进行人癌实验性治疗的研究。结果证明GnT-V-shRNA治疗后瘤体体积明显缩小。. 综上所述， GnT-V可催化胶质瘤细胞的PTP μ聚糖β1,6 GlcNAc分支的增多，促使PTP μ被蛋白酶依次剪切，使其失去细胞-细胞间的粘附功能，降低PTP μ的酪氨酸磷酸酶活性，失去对RTK的拮抗功能，激活下游PLCγ1/DAG/PKC信号，促进细胞边缘粘着斑的形成,加强了胶质瘤细胞迁移能力。