基于vasa基因的中华绒螯蟹早期性别分化机制研究

我们已经发现在中华绒螯蟹(河蟹)中存在"伪雄蟹"的特例，表明其性别分化可能会受到外界环境因子或自身生理因素的干扰。本项目拟立足在生殖腺中特异表达的vasa基因,研究河蟹性别分化的机制。通过同源克隆、RACE等技术获得河蟹vasa基因cDNA全序列；进一步以vasa作为分子标记，通过原位杂交、免疫组化等技术揭示河蟹原始生殖细胞发生、迁移、分化及性腺形成的规律；采用吗啉修饰的反义寡核苷酸敲降技术抑制胚胎发育过程中vasa基因的表达，初步探明河蟹vasa基因的功能，阐明河蟹早期性别分化的机制。在此基础上，通过环境内分泌干扰物及温度对河蟹胚胎发育的人工干预，获得环境因子影响河蟹性别的证据，确定明显提高单性比例的温度可控点，从而拟定可应用于生产实践的人工调控河蟹性别分化的策略，为其今后有望进行的单性化养殖奠定基础。

为了研究中华绒螯蟹性别分化的机制，本研究首先应用连续石蜡切片法研究了中华绒螯蟹性腺开始分化的时间节点，发现在溞状幼体Ⅳ期时，原始生殖细胞已开始迁移至背主动脉腹面进行定居；至大眼幼体期出现雌雄性腺的原型。接着，采用RACE技术克隆并获得了vasa基因cDNA全序列。中华绒螯蟹vasa cDNA全长2162bp，共编码560个aa，蛋白质分子量61.9KD，含有DEAD-box家族的9个结构域和GG重复序列，在性腺中特异性表达。为了了解中华绒螯蟹vasa的功能，分别选取了胚胎发育中5个时期、溞状幼体各期及大眼幼体期，检测了vasa基因在此发育过程中的表达。发现vasa的表达在胚胎发育阶段要高于后续的幼体发育阶段，在心跳期达到峰值，表明vasa 的作用主要体现在胚胎阶段。原位杂交结果表明，vasa在各级生精细胞中表达，在次级精母细胞中主要分布于染色质中，而在精细胞中则主要分布于核杯中，在卵细胞中主要分布于细胞质中。进一步以vasa基因作为分子标记在河蟹幼体发育中示踪生殖腺的形成。最初的生殖腺原基为胚胎膜内的一物质团，至心跳期已比较明显，溞状幼体Ⅰ期时分布于头胸甲与腹部交接处，位于颚足的下方，随着发育逐渐向上方迁移，至溞状幼体Ⅱ期时已完全迁移至头胸甲，溞状幼体Ⅲ期已有生殖腺的雏形，至大眼幼体时已完全形成。.与vasa同为DEAD-box家族的PL10基因是vasa基因的祖先，vasa mRNA和nanos mRNA是性腺的最初成分P 颗粒中的2个最重要的组成成分，另一基因piwi能造成vasa基因的转录沉默。本研究克隆了中华绒螯蟹PL10、nanos和piwi 3个基因，分别研究了这3个基因在中华绒螯蟹精巢、卵巢各发育时期的表达模式，在胚胎和幼体发育阶段的表达模式。采用原位杂交研究了piwi和nanos在卵巢和精巢中的定位，将其作为分子标记示踪了生殖腺的形成。在胚胎发育各期及溞状幼体阶段，vasa和nanos的表达模式相似，说明在生殖腺形成过程中两者功能相近。通过转录组测序和分析，研究了中华绒螯蟹在转录组水平的性别分化差异。发现精巢和卵巢在KEGG路径中前25个含序列最多的代谢通路、与生殖相关的基因种类和丰度上均存在差异。经对转录组测序数据的SSR和SNP分析，获得了8061个微卫星序列，11566个SNP，研究结果为后续性别差异的SSR和SNP分子标记筛选打下了基础。