木质纤维素水解酶特异性配体的筛选及其在检测芯片中的应用基础研究

The development of efficient catalysts for lignocelluloses degradation is one of the most important areas in cellulosic ethanol production. All components in the multi-enzyme complex work synergistically to hydrolyze effectively lignocellulosic biomass into the fermentable sugars. Thus, a method for rapid and sensitive detection of each component would be of great value in investigating the synergism. In this study, seven enzymes including exoglucanase I,exoglucanase II, endoglucanase I, endoglucanase II, xyloglucanase, β-glucosidase and β-xylosidase secreted from the strain QM9414 of T. reesei will be purified. By using phage display and biopanning, these seven enzymes will used as targets to incubate with the f8/8 landscape phage library to screen their respective phage monoclones,on which the octapeptides are considered as ligands with good affinity.Then ELISA, phage capture experiment and inhibition ELISA will be carried out to evaluate the specificity of the ligands obtained. Further, seven ligands (in the form of phage monoclone) with good affinity and good specifity for corresponding targets will be immobilized efficiently onto the microarray,which are used as probes to capture the corresponding targets labeled with fluorescencent dye. Finally, a protein microarray method will be developed for high-throughput analysis of seven lignocellulose hydrolysase sensitively. This proposed protein microarray would be useful for study on synergism, facilitate the productivity of better multi-enzymes preparations and discover the mechanism of the lignocellulose hydrolysis.

高效催化剂的研发是纤维素乙醇工业的一个重要领域。复杂纤维素水解酶系中，各组份协同作用能够有效地降解木质纤维素为单糖。不同组份含量的同时检测方法，对研究酶系的协同性非常重要。本课题以产自里氏木霉QM9414中的外切葡聚糖酶I、外切葡聚糖酶II、内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、木聚糖酶、β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶等七种多糖水解酶组份为靶标，利用噬菌体展示技术，分别从f8/8风景噬菌体文库中高效地淘选，获得一系列噬菌体单克隆（其表面有结合靶标的配体）。通过特性评估，测试所得配体的亲和性和特异性，确定针对不同靶标特异性好且亲和性高的配体。以噬菌体为载体，将上述七种配体高效共价固定于芯片表面，构筑蛋白质芯片，用于捕获荧光标记的木质纤维素水解酶，实现对上述七种组份高通量、高特异性、高灵敏地快速检测，这将为木质纤维素水解酶各组份间协同性研究、高效催化剂的研发及生产、木质纤维素降解机理的研究等奠定基础。

生物芯片具有体积小、重量轻、成本低、便于携带、高通量、分析过程自动化、分析速度快、所需样品少等优点而受到广泛关注。然而，随着多肽芯片应用的逐步深入，对其要求也越来越高。本论文针对目前多肽芯片制备过程中的不足，提出了借助对称载体构筑多肽芯片的策略，成功构筑了性能优良的多肽芯片。. 首先，以里氏木霉菌株QM9414为模型，联合离子交换和凝胶过滤层析，发展了一种纯化多种木质纤维素酶的方法。经酶活、SDS-PAGE、质谱，鉴定所得到的六种组份分别为外切葡聚糖酶I（CBH I）、外切葡聚糖酶II（CBH II）、内切葡聚糖酶I（EG I）、内切葡聚糖酶II（EG II）、木聚葡聚糖酶、β-木糖苷酶六种不同类别的木质纤维素酶。首次从T. reesei菌株QM9414的粗酶制品中纯化获得木聚葡聚糖酶。此外，还发现了一些熟知组份的新活性，如EG I和β-木糖苷酶的木聚糖酶活性、β-木糖苷酶的外切葡聚糖酶活性等。. 第二，将纯化得到的六种木质纤维素酶分别与f8/8风景噬菌体文库进行生物淘选，针对每一纤维素水解酶组份，都挑选了数个噬菌体单克隆。噬菌体捕获测试结果表明，成功筛选获得了特异性结合CBH II、EG I、EG II和β-木糖苷酶的八肽配体，它们分别为八肽ETGPHPFM、八肽EGSDPRMV、八肽GEYVSPLP和八肽DSTKSQSA。其中八肽DSTKSQSA对β-木糖苷酶的亲和性较低。. 第三，发展了一种借助对称载体的多肽固定方式。以针对EG I的特异性八肽配体EGSDPRMV为模式，借助对称载体Ff噬菌体，直接固定风景噬菌体EGSDPRMV，构筑多肽芯片。作为对照，将风景噬菌体EGSDPRMV中的主要衣壳蛋白，即融合有多肽EGSDPRMV的pVIII（pVIII-EGSDPRMV），分离纯化，采用传统的固定策略，进行多肽芯片的构筑。噬菌体EGSDPRMV介导的多肽芯片，其产生的荧光信号重现性更高，其强度比pVIII-EGSDPRMV介导的多肽芯片高4倍多，表明我们提出的基于对称性载体固定多肽的方法效率更高。另外，使用风景噬菌体EGSDPRMV，构筑多肽芯片，不仅简化了多肽芯片的构筑流程，还显著提高了检测灵敏度，这主要是由于每一斑点中所固定多肽的浓度得到了明显提高。此外，该固定策略还不受多肽配体组成的影响，并且固定的多肽拥有自由的氨基端。