木质纤维素玉米芯诱导合成纤维素酶的机理研究

纤维素酶组分复杂，诱导表达调控机理研究尚未透彻，致使酶活性低及生产成本高仍为其生产的瓶颈。我们的前期工作发现以玉米芯为原料产酶水平优于其他木质纤维素，使其作为微晶纤维素的替代原料进行纤维素酶工业化生产成为可能。因此，本项目在此基础上提出"高含量的半纤维素是导致玉米芯纤维素酶活提高的原因，其水解产物半乳糖、木聚糖很可能是除纤维二糖和槐糖外的主要诱导物，且几个诱导物之间可能存在协同作用"这一假说。我们以里氏木霉RutC30及其突变株S313为研究对象，通过基因序列比对，获得导致突变株高产的关键基因，并对这些基因进行功能分析。确定玉米芯中的关键诱导物，采用RT-PCR分析它们对纤维素酶编码基因mRNA表达的影响。探讨玉米芯中各诱导物对纤维素酶诱导的相互作用，构建多诱导物诱导模型。本研究有助于纤维素酶诱导和合成机理的阐述，可为降低纤维素酶生产成本提供理论依据，具有重要的理论和实际意义。

在木质纤维素生物质能源利用的研究背景下，本项目针对木质纤维素玉米芯可高效诱导里氏木霉产纤维素酶的这一过程，从酶活、转录和蛋白三个水平分别分析玉米芯诱导里氏木霉产酶的过程，分析并确定玉米芯中的关键诱导因子，挖掘功能基因和转录调控因子，构建多诱导因子共同作用的玉米芯诱导里氏木霉产酶过程模型。本项目的研究工作按照项目计划书开展，基本完成年度进度指标，并最终超额完成项目的预期研究目标。通过本项目的研究，取得的成果如下：1、通过酶的产量分析（测定纤维素酶和木聚糖酶酶活）、主要酶及转录因子编码基因mRNA的测定（RT-PCR）以及分泌蛋白质组（SDS-PAGE结合MALDI-TOF-MS/MS测序）的初步分析，从酶活、转录和蛋白三个水平进一步验证了木质纤维素玉米芯作为里氏木霉纤维素酶系诱导物优于微晶纤维素，而后者被认为是里氏木霉工业化生产纤维素酶系的最佳诱导碳源；2、通过采用里氏木霉 Rut C30以玉米芯为底物发酵所得粗酶液对玉米芯和预处理后的玉米芯进行水解，HPLC检测酶解液中糖的组成和含量变化，并以水解物分别和组合诱导里氏木霉产酶，最终确定了玉米芯中的关键诱导组分除纤维二糖和槐糖外，还包括木寡糖和半乳糖；3、通过对里氏木霉发酵产纤维素酶过程研究以及pH对发酵产酶的影响分析，确定了pH为影响里氏木霉诱导产酶的关键环境因子，通过BLASTP搜索T. reesei基因组数据并识别了Aspergillus nidulnas PacC同源的与pH调控有关的转录因子TrPac1，通过敲除编码其的基因确定了TrPac1在中性pH条件下对主要纤维素酶编码基因起负调控作用。通过以上研究与分析，最终我们初步构建了玉米芯诱导里氏木霉的产酶过程模型。研究结果共发表国内外研究论文8篇，其中SCI检索文章6篇，中文核心2篇；培养硕士研究生3名，其中已答辩1名，在读2名。本项目的研究成果不但为最终揭示里氏木霉纤维素酶表达调控及合成机理、构建纤维素酶高效表达菌株提供有力的理论依据，还为纤维素酶高效低成本生产及木质纤维素原料的高效利用提供新的思路。