单细胞表面ATP释放原位动态检测分析系统研究

Extracellular ATP release has been demostrated to be an important purinergic signalling in neural mediation, homeostasis regulation, cell apoptosis, and tumor cell death. However, the cellular ATP release and regulation mechanism is still not very clear. Analysis research of purinergic signaling has been slowed by lack of direct methods for measurement of cellular purine release in real-time. Further research will be from the behavioural and histological level to the single cell level. Therefore, in situ dynamic analysis of ATP release on a single cell surface is of great significance. This project focus on the research of preparation and modification methods of hierarchical nanopore based electrochemical ATP biosensing electrodes with high detection precision and time resolution, and the development of in situ dynamic monitoring and analysis system of single cell surface ATP release with single cell directional culture, microfluidic flow injection and rapid ATP detection. On this basis, this project is also intended to research and explore single cellular ATP release mechanism and ATP regulated apoptosis of tumor cells with glial cell model. This project research has important value to the research of neural information regulation mechanism, cell apoptosis, and anticancer immunity.

细胞表面ATP释放在神经信息调节、机体发育与内平衡调控、细胞凋亡与肿瘤细胞清除等生理过程中发挥重要作用，然而细胞ATP释放机制及调控机理尚不明确，进一步研究必将从行为学和组织学层面向单细胞层面深入。因此，对单细胞表面ATP释放进行原位动态检测分析研究具有重要意义。本项目针对当前单细胞表面ATP释放动态监测困难、检测精度不高、时间分辨率低等问题，探索基于分级嵌套微纳孔洞阵列的高灵敏高响应电化学生物传感电极制备与修饰方法，研制集单细胞定点培养、微流体流动注射、ATP原位快速检测于一体的单细胞表面ATP释放检测分析系统，为单细胞ATP释放动力学过程与释放机制研究提供技术基础，并在此基础上以神经胶质细胞为实验模型开展关于单细胞ATP释放机制以及凋亡肿瘤细胞ATP释放与调控等方面的研究与探索。本项目研究对神经信息学领域信息递质释放与调控机理认知，细胞凋亡调控与癌症免疫等方面的研究发展具有重要价值。

三磷酸腺苷（ATP）除了为机体提供能量来源之外，作为信息递质，在神经信息调节、机体内平衡调控、细胞凋亡、肿瘤细胞清除等方面具有重要的生理意义，而其释放机制及调控机理尚不明确。因此对单细胞表面ATP释放进行原位动态检测分析研究具有极其重要的意义。. 本项目基于电流型电化学检测的方法，采用葡萄糖氧化酶/己糖激酶的双酶体系，通过测量H2O2电化学响应电流的变化测得ATP的浓度。主要研究内容包括电化学丝网印刷电极研究、针状微电极研究、单一平面微电极研究、平面微电极阵列研究、细胞培养与检测等五个部分内容。提高ATP酶生物传感器的灵敏度和响应速度，是单细胞ATP释放实时监测和分析研究得以实现的关键技术，也是本研究的核心。研究中涉及的主要关键技术点有酶的固定化、电极的微型化和细胞水平的检测。. 在电化学丝网印刷电极研究中，成功检测出ATP信号，通过参数优化将检测灵敏度提升至20.1 μA mM-1 cm-2，并达到1 μM检测限。在直径为50 μm铂丝针状微电极研究中，灵敏度可达50 nA/mM。在单一平面微电极研究中，采用可重复打磨使用的直径为12.5 μm的微金圆盘电极，灵敏度达40 pA/mM。在平面微电极阵列研究中，增加了金-铂复合微结构修饰层，灵敏度达130.59 nA mM-1，检测限降至20 μM。在细胞培养与检测研究中，初步选取SK-HEP-1细胞培养于平面微电极上方，位于细胞下方的被修饰过的电极可直接检测到从上方细胞中释放出来的ATP。. 本项目研究提出了一种可实时监测细胞释放ATP的分析测试平台和技术路线，为细胞释放ATP的机理研究提供了平台。该成果可扩展至其他细胞分泌物释放的实时检测中，如乳酸、多巴胺、NAD+、活性氧、Ca2+、microRNA、氨基酸等等，为研究其机理提供了强有力的技术支撑。该成果还可用于肿瘤细胞分泌物检测上，为深入探究细胞凋亡和肿瘤细胞清除等生理过程提供依据。该实验平台还能和光学检测相结合，在针对弱信号检测的课题研究中，发挥联合检测的优势。