Vc-Jak2-Stat2信号转导途径在体细胞核移植表观重编程中的调控功能

Incomplete DNA demethylation and abnormal imprinting in epigenetic reprogramming are the two important factors that lead to the failure of somatic cell nuclear transfer (SCNT). While promotes demethylation of somatic cell genome, Vitamin C（Vc）can also protect and maintain normal imprinting. Our researches indicated that Vc can activate intracellular Jak2-Stat2 signal transduction pathway, and facilitate the development of somatic cloned embryos with Vc-treated bovine fibroblast as donor cells. Based on our existing research, we suggest that Vc-Jak2-Stat2 pathway may function in epigenetic reprogramming induced by vitamin C. Therefore, we apply to this project to further study the regulatory functions of Vc on epigenetic reprogramming in bovine fibroblast cells. We will focus on elucidating the molecular mechanisms of Vc-Jak2-Stat2 pathway in DNA methylation reprogramming and imprinting maintenance, and reveal the mechanism of the increasing development rate of somatic cloned embryos arisen from epigenetic reprogramming in donor cells induced by Vc. These studies not only reveal a new direction for the further research in cell reprogramming mechanism , but also provide new ideas and methods for improving efficiency in livestock nuclear transplantation, thus speeding up livestock breeding and propagation.

DNA甲基化重编程不完全以及印记基因重编程异常是导致核移植失败的重要因素。维生素C（Vitamin C, Vc）在促进体细胞基因组发生去甲基化的同时，还可以保护和维持印迹正常。我们发现Vc可以激活细胞内Jak2-Stat2信号转导途径，并且以Vc处理的牛成纤维细胞做供核细胞，可以促进体细胞克隆胚胎的发育。在现有研究基础上，申请人推测Vc-Jak2-Stat2途径可能参与了Vc介导的细胞表观重编程调控。因此，本项目申请进一步研究维生素C对牛成纤维细胞表观重编程的调控功能，重点解析和完善Vc作为信号分子在DNA甲基化重编程和印记维持两个方面的调控机制，并揭示Vc诱导的供核细胞重编程对体细胞克隆胚胎发育率提高的作用机理。以上研究不仅可以为进一步揭示细胞重编程机制指引新的方向，还可为家畜体细胞核移植效率的提高提供新的思路和方法，进而加快我国畜牧业良种的培育和扩繁。

在解析Vc诱导Jak2-Stat2激活详细机制方面，我们通过实验证明Vc的运输蛋白SVCT2是一个Vc特异的Jak2结合受体样蛋白。Jak2的磷酸化激活依赖于其与SVCT2的特异结合并且依赖于Vc运输；激活的Jak2磷酸化SVCT2的C末端，而SVCT2的C末端被磷酸化后一方面作为招募STAT2的停靠位点，促进Jak2对STAT2的磷酸化激活，另一方面C末端的磷酸化会促进SVCT2的Vc运输活性。.在解析Vc-Jak2的信号转导途径方面，以Vc作为辅因子的酶TET3可以被Vc激活的Jak2磷酸化并促进其氧化活性，导致基因组中5mC的降低和5hmC的升高。Jak2直接磷酸化组蛋白H3Y41。这些组蛋白修饰会导致细胞染色质结构开放，我们推测其功能是辅助TET或组蛋白去甲基化酶的去甲基化作用。（以上结果目前处于文章投稿阶段）.使用Vc处理供核细胞，可以促进核移植胚胎的卵裂率，相比于IVF胚胎的68.5%和未处理组核移植胚胎的51.8%，Vc处理组胚胎的卵裂率达到了65.0%; Vc处理组核移植胚胎囊胚率也比未处理组获得显著提高（42.2% vs 27.6%），接近IVF胚胎的体外囊胚发育率（42.2% vs 47.8%）。通过转录组测序，我们发现在未处理克隆胚中异常表达的“自噬”相关基因在Vc处理组克隆胚中则得到显著改善。为了进一步证明自噬途径的对克隆胚发育的重要作用，我们使用自噬激活剂雷帕霉素处理2-细胞克隆胚，显著促进了克隆胚的囊胚发育率（36.0% vs. 25.6%）。此外，2-细胞未处理组中异常表达的13个基因和未处理囊胚异常表达的11个基因在Vc处理组得到完全恢复（包括ZNF641），并且克隆胚中过表达ZNF641，可以调高囊胚发育率和囊胚质量。此外，我们还发现在未处理组2-细胞克隆胚异常表达的24个lncRNA和13个囊胚异常表达的lncRNA在Vc处理组都得到了完全恢复。