瑞士乳杆菌遗传多样性与ACE抑制活性相关性研究

依托内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库保藏的259株L.helveticus，结合实验室已完成的2株L.helveticus(H9和H10)及公共数据库中2株L.helveticus全基因组信息，首先采用生物信息学方法预测，分析L. helveticus蛋白水解系统，定位相关功能基因、基因簇。采用多位点序列分型技术从菌株个体出发，由点及面，分析不同L. helveticus菌株相关功能基因多样性，进而完成乳酸菌功能基因与ACE抑制活性关联分析，解析关键基因突变与ACE抑制活性关系；然后通过RT-PCR对功能基因的生物学功能进行验证，完成L.helveticus ACE抑制活性功能基因的精细定位，比较分析具有不同ACE抑活性菌株的功能基因表达差异，全面解析其调控机理、机制，最终构建ACE抑制活性乳酸菌的高通量快速筛选分子技术体系，为加速乳酸菌抗高血功能性乳制品的开发和应用奠定基础。

本项目依托内蒙古农业大学乳酸菌资源库中的259瑞士乳杆菌，采用生物信息学方法、蛋白质组学技术、多位点序列分型技术、RT-PCR定量技术等获得以下成果：. ①构建了L. helveticus H9在乳中发酵不同生长时期的蛋白质组参考图谱，分析菌株在不同生长时期的蛋白质表达情况，重点分析乳酸菌的蛋白水解系统相关信息。. ②通过二维凝胶电泳图谱得到菌株在三个生长时期的蛋白斑点数，分别为729、1020和925个。其中差异蛋白点275个，其中233个鉴定成功，对鉴定成功的蛋白点进行了COG功能分类，主要是与翻译、核糖体结构和合成相关蛋白；核酸转运及代谢相关蛋白；碳水化合物转运及代谢相关蛋白；氨基酸转运及代谢相关蛋白等。. ③蛋白质谱鉴定中与蛋白水解系统相关的蛋白PepN、PepE、PepO2以及OppC是在对数生长期和稳定期都表达的蛋白，这与发酵试验中在这两个时期可以检测到ACE抑制活性的结果相一致，所以我们初步推测Opp转运系统是菌株在乳中生长利用乳蛋白所必须的，PepN、PepO2以及PepE可能与菌株在发酵乳的过程中产ACE抑制肽具有相关性。. ④采用RT-PCR技术研究了L. helveticus H9蛋白水解系统关键酶基因的表达变化情况；同时还对蛋白质组学研究中出现的部分蛋白点进行了基因表达验证，结果表明不同的基因具有不同的表达模式。. ⑤本研究中我们开发了一种用于瑞士乳杆菌分析的MLST分析手段，并基于此分析了245株乳酸菌的群落结构和系统进化关系。结果表明：所有瑞士乳杆菌来源于3个祖先亚群分别是酸马奶，tarag和随机混合群体，来源于特定环境的瑞士乳杆菌有着特殊的群落结构。我们的研究也为瑞士乳杆菌的遗传进化主要来源于点突变而不是遗传重组提供了证据。此外，11个MLST基因和pepO和carB基因的位点系统发育分析表明，瑞士乳杆菌产抗高血压肽的表型与基因型之间有良好的对应关系。. 围绕上述研究共撰写9篇学术论文，（已发表论文7篇，其中SCI收录5篇），授权发明专利1项，该项目研究成果为构建ACE抑制活性乳酸菌的高通量快速筛选分子技术体系和加速乳酸菌抗高血功能性乳制品的开发和应用奠定基础。