外排泵在临床分离痤疮丙酸杆菌多重耐药性中的功能研究

Acne is a common chronic inflammatory dermatitis, the relationship between Propionibacterium acnes and acne is most closely. But the drug resistance problem becomes serious. Our previous study based on the sequencing of bacterial 23S rRNA coding region was found that parts of the Propionibacterium acnes did not have typical resistant gene mutation but produced multiple drug resistance. From the following 3 aspects, this project focuses on the study of multiresistance of Propionibacterium acnes with efflux pump genes: (1) amplificating and deep sequencing efflux pump genes LmrA, QacA, NorM, QacC and MsrA, and analyzing the gene homology; (2) with pMW535 vector, transferring the target gene into standard strain through inframe replacement, constructing a RNA interference system and using gene silencing to verificate the importance of efflux pump genes in the Propionibacterium acnes resistance; (3) using MC207,110 efflux pump inhibitors to clear efflux pump genes with drug sensitivity test in vitro. This project aims to clarify the antibiotic efflux mechanism and the spread characteristics of drug resistance in Propionibacterium acnes, to conduct the clinical use of antibiotics rationally which has significant importance to prevent the spreading of drug resistance, and to provide new ideas for targeted therapy.

痤疮是一种常见的慢性炎症性皮肤病，痤疮丙酸杆菌与痤疮的关系最为密切，其耐药性问题日趋严峻。我们前期的研究依据细菌23S rRNA编码区测序发现部分多重耐药痤疮丙酸杆菌没有典型的耐药基因突变。本课题拟从以下3方面深入研究外排泵基因在痤疮丙酸杆菌多重耐药性中的功能：（1）扩增和深度测序外排泵基因LmrA、QacA、NorM、QacC和MsrA，并对其同源性和功能变化做出分析；（2）以pMW535质粒为载体，通过同框替换将目的基因导入标准菌株，考察耐药性获得情况。构建RNAi系统，对外排泵进行基因沉默，考察耐药性丧失情况；（3）利用MC207，110外排泵抑制剂，通过体外联合药敏试验，明确外排泵基因的作用。通过本项目的研究，阐明痤疮丙酸杆菌对部分临床常用抗生素的主动外排机制及耐药性传播扩散特性，对于指导临床合理使用抗生素和防止耐药株的流行有着重要意义，并为发掘新的临床治疗策略提供新思路。

痤疮是一种累及毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病，毛囊皮脂腺单位中有多种微生物存在，其中以痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）与痤疮的关系最为密切，但随着抗生素在痤疮治疗中的广泛使用，其耐药问题日趋严峻。而现有研究表明，细菌的主动外排是导致细菌产生多重耐药的主要原因。本研究中，我们通过23S rRNA保守序列测序、全基因组重测序及生物信息学分析等方法，对P.acnes多重耐药相关外排泵基因进行筛查和突变分析。研究发现，77株临床分离P.acnes中对红霉素、克林霉素、莫西沙星同时耐药的有3株（3.9%），对该3株多重耐药菌（s17、s39、s51）进行全基因组注释分析，均检测到5个多重耐药的外排泵基因：Bmr3，NorM，yfmO，yga，yhe，且没有发现明显的突变位点。通过对外排泵基因上游调控区域基因进行检测和比对，发现Bmr3、Norm受转录因子TetR调控, yfmO受MarR调控。由此预测，抗生素结合TetR和MarR可激活对外排泵的转录，引起P.acnes多重耐药表型。由于筛查到的外排泵基因在P.acnes中都比较保守，没有发现明显的突变位点。因此考虑在耐药菌与非耐药菌中，外排泵基因可能存在表达差异。为验证这种设想，我们进一步设计了“抗生素诱导实验”，检测在正常培养条件和抗生素筛选条件下不同菌株外排泵基因的表达差异。研究表明，在无抗生素的条件下，耐药菌外排泵基因表达量与标准菌株比较无明显差异；而在抗生素诱导条件下，耐药菌外排泵基因表达量有明显上调。综上所述，本研究表明，对于耐药相关的外排泵基因，在基因组水平上，多重耐药菌和非耐药菌无明显差异，而在抗生素选择压下，多重耐药菌株外排泵基因表达有明显上调，提示多重耐药菌株中可能存在更为复杂的调控机制，相应抗生素选择压诱导外排泵基因表达上调，因而为P.acnes耐药机制的研究及痤疮治疗新靶点提供了理论和实验依据。