胸膜肺炎放线杆菌RND外排泵系统介导的多重耐药性机制研究

Bacterial antibiotics resistance, especially multidrug resistance, continues to be a global public health concern. Actinobacillus pleuropneumoniae is the causative agent of porcine pleuropneumonia, one of the most important infectious respiratory diseases in pig. In recent years, increasing levels of multidrug resistance have been reported worldwide while little attention was paid to the mechanisms of multidrug resistance in A. pleuropneumoniae. Previous studies indicate that bacterial RND efflux pump systems play an essential role in multidrug resistance of Gram-negative bacteria. By contrast, little information of RND efflux pump in A. pleuropneumoniae is known. Here we propose to study molecular, antigenic and regulatory characteristics of the RND efflux pump system involved in multidrug resistance in A. pleuropneumoniae. Firstly, the RND efflux pump system AcrAB-TolC in A. pleuropneumoniae will be identified and analyzed on gene sequence and protein structure by bioinformatics and molecular approaches, and its prevalence will be also investigated in all serovars of A. pleuropneumoniae. Secondly, mutants of acrA, acrB and tolC will be constructed by homologous recombination and used for identification and analysis of individual gene on multidrug resistance. Finally, the mechanism of the RND efflux pump on multidrug resistance will be analyzed by site-directed mutagenesis and efflux pump inhibitors. Moreover, the local regulator AcrR of the RND efflux pump will be identified in A. pleuropneumoniae. Based on acrR mutant, its regulatory characters on expression levels of the RND efflux pump and global genes in A. pleuropneumoniae will be analyzed by transcriptomic and proteomic approaches. The results of this study will be helpful for understanding the mechanism of multidrug resistance mediated by the RND efflux pump in A. pleuropneumoniae.

细菌耐药性特别是多重耐药性是一个全球性的公共健康问题。胸膜肺炎放线杆菌作为一种重要的猪呼吸道病原细菌，近年来多重耐药性问题日益突出，但耐药性机制研究比较薄弱。研究显示RND外排泵系统在细菌多重耐药性方面发挥关键作用，因而本课题拟对胸膜肺炎放线杆菌RND外排泵系统参与的多重耐药性机制进行研究。在本课题中，首先鉴定胸膜肺炎放线杆菌RND外排泵系统AcrAB-TolC，进行基因序列和蛋白结构分析，并鉴定该系统在不同血清型菌株中的分布；进而分别构建外排泵系统acrA、acrB和tolC突变菌株，通过比较鉴定这些基因对细菌耐药性的影响；最后利用基因点突变和受体阻断技术鉴定外排泵系统的耐药性作用机制。此外进一步鉴定该外排泵系统调控因子AcrR，利用转录组学与蛋白组学技术鉴定调控因子AcrR对RND外排泵系统以及细菌所有基因的调控作用。研究结果对深入理解胸膜肺炎放线杆菌多重耐药性机制将具有重要意义。

细菌耐药性特别是多重耐药性是一个全球性的公共健康问题，严重威胁人类和动物的健康。胸膜肺炎放线杆菌作为一种重要的猪呼吸道病原细菌，近年来耐药性问题日益突出，但耐药性机制研究比较薄弱。.研究显示RND外排泵系统在革兰氏阴性细菌多重耐药性方面发挥关键作用，因而本课题首先对胸膜肺炎放线杆菌RND外排泵系统参与的耐药性机制进行研究。根据RND外排泵系统的结构和分子特征，在胸膜肺炎放线杆菌中鉴定了两种RND外排泵系统，进而对两种外排泵系统中的8种基因分别进行基因失活突变菌株的构建。除tolC1基因突变菌株未构建成功外，我们构建成功其它7种基因失活突变菌株，同时将8种基因插入质粒表达载体中构建过表达菌株。所有基因失活突变菌株和基因过表达菌株对不同类别抗生素的药敏测定结果显示，与母源菌株比较无显著差异，预测的RND外排泵系统在胸膜肺炎放线杆菌耐药性方面的作用需进一步鉴定。.由于胸膜肺炎放线杆菌临床分离菌株对环丙沙星、四环素、氨苄青霉等耐药性报道越来越多，为解析胸膜肺炎放线杆菌对这些抗生素的耐药性机制，通过逐代适应亚抑制浓度抗生素诱导获得该菌血清1型和7型参考菌株环丙沙星、四环素、氨苄青霉素高耐药菌株，进而对这些高耐药菌株生物学特性及耐药机制进行研究。环丙沙星耐药菌株不但对喹诺酮类药物产生耐药性，而且对氨苄青霉素产生交叉耐药性；菌株生长能力较母源菌株显著降低；喹诺酮靶基因QRDR分析显示gyrA和parC基因突变是耐药性升高的关键因素，同时环丙沙星累积试验测定结果显示外排泵在耐药性方面也发挥重要作用；环丙沙星耐药菌株生物膜形成能力发生显著变化，且分泌Apx毒素的能力显著降低。利用RNA-Seq技术鉴定了胸膜肺炎放线杆菌环丙沙星和四环素耐药菌株基因组在转录水平的变化，结果显示分别有837个和686个基因表达差异显著。研究结果对深入理解胸膜肺炎放线杆菌临床菌株在抗生素诱导下的表型及遗传变化、以及在亚抑制浓度下解析革兰氏阴性细菌耐药性机制将具有重要意义。