探寻与先天性心脏病相关的心脏发育特异转录因子基因新变异

80％的先天性心脏病（先心）以散发形式出现，对于这部分先心的遗传机制目前仍知之甚少，是否存在起源于病变心肌细胞的体细胞突变或新的遗传变异，尚不清楚。基因拷贝数变异（CNV）是近年来受到广泛关注的一类新的遗传变异，已被证明与人类多种疾病相关；心脏特异转录因子基因在心脏发育尤其是间隔形态发生中发挥重要作用。本课题以间隔缺损型先心为主要研究对象，结合大样本病变心肌组织标本，应用突变筛查和CNV检测策略，探寻是否存在心脏特异转录因子基因（NKX2.5、GATA4、TBX5）体细胞突变或拷贝数变异；同时通过与加拿大Dr.Andelfinger实验室合作，探讨上述基因变异分布是否存在种群差异，在阐明心脏特异转录因子基因变异与先心关系的同时，论证体细胞突变和CNV是先心致病基础的假说，以期探寻先心病研究的新策略。

第一部分 体细胞突变与先心关系研究.【方法】选择100例于我院接受开胸手术的非综合征型先心患儿为研究对象（48例ASD，25例VSD，27例TOF），采集患儿病变心肌组织和外周血淋巴细胞并提取DNA。聚合酶链式反应（PCR）扩增NKX2.5、TBX5、GATA4基因编码序列及内含子－外显子拼接部位，直接双向测序分析。.【结果】 在1例TOF患儿发现NKX2.5基因新的杂合突变p.V303I，在其父母和对照组中均未发现该突变；在1例VSD患儿发现NKX2.5基因已知杂合突变p.S179F；在4例患儿发现NKX2.5基因同义突变（rs3729753），其中3例是VSD合并ASD，1例TOF。在1例TOF患儿发现GATA4基因已知杂合突变p.P407Q；发现GATA4基因5个新的单核苷酸多态性位点，其中1个为位于exon7的同义突变c.1326G>A（p.A442A）。未发现TBX5基因编码区的突变。比较SNP基因型频率及等位基因频率病例组及对照组均没有显著性差异。上述所有发现的变异均同时存在患儿心肌组织和外周血DNA中，未发现体细胞突变的存在。.【结论】 未发现体细胞突变的存在，体细胞突变成为先心发病机制的可能性较小。.第二部分 拷贝数变异与先心关系的研究.【方法】采用多重连接依赖的探针扩增技术(MLPA)对238例散发性间隔缺损为主的、非综合征型CHD患者进行分析，包括78例ASD，58例VSD，102例TOF。.【结果】 未发现与NKX2.5、GATA4、TBX5基因直接有关的CNV。在11例CHD中发现11个CNV (4.6%)，其中10例为TOF。在8例（3.3%）CHD中发现22q11.2缺失，均有TOF表型，占TOF的7.9%，其中7个长度为3Mb；1例患儿的22q11.2缺失的长度在0.5-1Mb之间，覆盖了TBX-1基因，目前尚未有报道。在1例TOF中发现CRELD1基因重复片段，在其父母及正常对照组均未检出该CNV；该CNV片段为首次报道。在1例TOF患者中发现了GATA4上游片段缺失，在其父母及正常对照组均未检出该CNV。在1例ASD患儿中发现了4q22片段缺失。.【结论】散发CHD中存在一定比例的CNV；新发、少见的CNV可能与CHD发病有关。散发TOF 患者中存在较高比例的22q11.2缺失。