SEC15-STAT3蛋白小体分泌微环境对肿瘤干细胞转移干性调节

Breast cancer incidence increases markedly increased over the past years in China, suggesting non-genetic factors such as aberrant protein post-translational modifications or protein subcellular localization changes or epigenetic factors can be important mechanisms for breast cancer initiation and development. In triple negative breast cancer (TNBC) cells with metastatic property, cytokine activated STAT3 proteins bear multiple posttranslational modifications, leading to the formation of various STAT3 micro-vesicles or endosomes. Surprisingly, SEC15-dependent STAT3 microvesicle secretion rather than nuclear translocation maintains TNBC cell metastatic self-renewal growth property. Inasmuch, we hypothesize that STAT3's tumorigenecity and tumor cell stem properties depend on STAT3 activity in micro-vesicle formation and secretion, and, secreted SEC15-STAT3 microvesicle or exosome serves as an important niche for triggering intracellular signaling pathways for breast cancer stem cell metastatic self-renewal growth. To prove this hypothesis, we will apply mass spectrometry, transgenic mouse model, protein-based drug design and other approaches to 1) explore the mechanisms of SEC15-STAT3 microvesicle formation and cell membrane crossing in TNBC cells; 2) delineate signal transduction initiation by SEC15-STAT3 exosome in TNBC cells, and 3) explore SEC15-STAT3 exosome in maintaining stem properties including self-renew growth, metastasis, and drug-resistance of TNBC stem cells. Our research will provide the clue for the novel concept of protein microvesicleomics，novel mechanism of TNBC breast cancer heterogeneity, as well as new therapy.

在中国乳腺癌发病率的激增意味着蛋白质翻译后修饰、运输、和分布改变或表观遗传等非遗传因素可能是乳腺癌发生发展的重要机制。在三阴性乳腺癌细胞中，我们发现STAT3具有不同的修饰并形成多种蛋白小体。其中,SEC15依赖的STAT3蛋白小体通过分泌促进三阴性乳腺癌干细胞生长。在此我们提出假说：肿瘤细胞分泌STAT3蛋白小体形成特殊肿瘤干细胞微环境，激活信号通路、维持肿瘤干细胞自我更新、转移及抗药等干性生长。围绕这一假说,我们将运用免疫质谱联仪、新建基因敲除动物模型及蛋白质结构基础的药物设计等手段1)阐明SEC15-STAT3蛋白小体形成和跨膜之机理;2)揭示SEC15-STAT3胞外小体在乳腺癌干细胞所激活信号通路;3)探索SEC15-STAT3胞外小体对乳腺癌干细胞的生长转移复发干性调节及抑制STAT3胞外小体对乳腺癌的干预。为蛋白小体组学新概念、异质性三阴性乳腺癌新机理和治疗新方案提供依据。

STAT3是一个含有SH2域的转录因子。在细胞内STAT3可以被IL-6家族细胞因子激活。LIF是IL-6家族一成员，通过激活STAT3维持鼠干细胞的自我更新生长。激活的STAT3进入细胞核启动一系列多功能基因转录。然而，ERK通路和GS3K通路激活则对抗多功能基因的激活而抑制干细胞的干性生长。在本课题中，我们研究了在小鼠胚胎干细胞，STAT3进入多泡小体（MVB），随后以外泌体的形式分泌到细胞外去。LIF激活的STAT3以K177R发生乙酰化并和Sec15相结合。Sec15是MVB蛋白质分泌小体的成分。Sec15促进STAT3分泌到细胞外的微环境，从而阻止了ERK和GSK3激活，维持了胚胎干细胞的自我更新生长。我们制备了STAT3-K177R突变小鼠（STAT3mut/mut），STAT3由于带有K177R突变，无法进入MVB而依赖Sec15分泌。STAT3-K177R小鼠部分胚胎致死或者出生后死亡。这些存活小鼠都带有发育异常，尤其是血液系统。这和Sec15-/-小鼠是一致的。可能的原因是STAT3功能缺陷。这样，STAT3-分泌小体无法激活维干/分化通路，而维干/分化通路正是干细胞多功能的生长所必须的。STAT3可被CBP/p300乙酰化。乙酰化在STAT3二聚体形成和STAT3亚细胞器分布都起到很关键作用。STAT3可以被Sirtuin家族、HDAC家族，以及LOX家族成员去乙酰化。赖氨酸去乙酰化酶Sirtuin家族成员分布在不同亚细胞器而执行去乙酰化和NAD/NAM代谢调节。我们发现在巨噬细胞，Sirtuin家族成员SIRT2被分泌到细胞外环境成为eSIRT2。.在SIRT2-/-小鼠，整合素ITGB3胞外域乙酰化强度大大增强，细胞外域 NAD+/NAM比例改变。小鼠尾静脉注射肿瘤细胞转移放慢。我们利用我们的微环境模型，CYTOF技术和特异的eSIRT2抑制剂发现eSIRT2也可以靶向eSTAT3。我们利用质谱仪分析了分泌型STAT3的翻译后修饰位点，分析坚定了分泌型STAT3的结合蛋白。我们还利用二次超离心技术分离STAT3外泌体。此外，我们还利用转基因动物技术制备了STAT3-R31K突变小鼠，STAT3-K177R 突变小鼠。我们还制备了Sec15A-/-和Sec15B-/-小鼠。我们制备了抗STAT3-R31me抗体和STAT3-K177ack抗体。