COUP-TF1基因调控激肽原1参与增生性玻璃体视网膜疾病的机制研究

Proliferative vitreoretinopathy (PVR) is the leading cause of retinal detachment (RD) surgery failure. Our previous proteomic study firstly documented that kininogen 1 (KNG1) was the candidate serum biomarker, which could predict the severity and prognosis of PVR. Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor 1 (COUP-TF1) was the critical gene in PVR. However, the mechnaism of the regulation of KNG1 increased and the signal pathway of KNG1 worked was not known well. The references presented that COUP-TF1 could regulate kallikrein-binding protein (KBP). Therefore, we hypothesized that COUP-TF1 may regulate KBP to increase the expression of KNG1, which may inhibit progression of PVR via PKC/ERK signal pathway. To tset the hypothesis, the methods of gene knockout, siRNA interfere and slow virus vector transfection would be used into the mice PVR models and PVR cell models. The mechnaism of the regulation of KNG1 increased, the contribution of the KNG1 involved in PVR and the signal pathway of KNG1 would be investigated from the levels of molecular,cell, tissue and animal.This study would provide advanced recognition of the pathogenesis of PVR in the gene level and the new targets of anti-PVR biological drug.

增生性玻璃体视网膜病变 (PVR) 是孔源性视网膜脱离手术失败的最主要原因。本课题组首次发现激肽原1(KNG1)是预告PVR严重程度和预后的候选血清分子标志物，而COUP-TF1是重要的调控基因。但是调控KNG1升高的机制以及KNG1发挥作用的机制尚不明确。文献显示，COUP-TF1可调节激肽释放酶结合蛋白(KBP)的基因表达。因此，提出假说，COUP-TF1通过调节KBP使KNG1表达增加，KNG1通过PKC-ERK 信号通路抑制PVR。为了验证这一假说，本课题拟应用PVR动物和细胞模型，采用基因敲除、siRNA干扰、慢病毒载体转染等方法，从分子、细胞、组织和动物整体水平等多方面探讨COUP-TF1调控KNG1表达增加的机制，明确KNG1促进PVR发展的相关作用以及其作用的信号通路。本课题的完成将有助于从基因调控水平揭示PVR的发病机制，并为PVR的药物治疗提供新靶点。

目的：本实验通过动物模型，体外实验及人眼样本，研究COUP-TF1基因对ARPE-19 细胞发生EMT的影响和机制及其在PVR病程中的作用机制，为临床治疗提供新方向。方法：（1）建立PVR 动物模型（2）COUP-TF1基因沉默（3）体外EMT实验：将正常 ARPE-19 细胞、GFP细胞和KD细胞分别加入TGF-β1诱导发生EMT。通过CCK-8检测细胞增殖能力，划痕实验检测迁移能力，流式细胞仪检测细胞凋亡，免疫印迹法（western blot，WB）、免疫荧光检测相应标志蛋白的表达，q-PCR 检测相关mRNA 表达。（4）动物随机分为3组：A组为空白对照组，B组为阴性对照组，C组为实验组，观察三组动物的眼部体征和PVR 分级。通过病理切片观察视网膜病理结构改变、免疫组化染色和 WB 法检测视网膜中COUP-TF1蛋白表达。结果：（1）PVR患者眼中COUP-TF1的表达比正常人眼中COUP-TF1表达增加（2）与正常ARPE-19细胞相比，GFP、KD细胞增殖降低。加入TGF-β作用48h 后，ARPE-19细胞增殖变强，KD 细胞增殖降低。KD组细胞迁移能力降低。加入TGF-β1作用 24h，ARPE-19细胞迁移能力增强，KD 组迁移能力下降。COUP-TF1基因沉默对ARPE-19细胞凋亡无影响。通过 WB、免疫荧光、q-PCR显示，KD组细胞COUP-TF1蛋白低表达。加入TGF-β1后，ARPE-19、GFP 细胞E-钙黏素表达下调，α-SMA表达上调，COUP-TF1表达无明显变化，KD 组 E-钙黏素表达下降，但比 GFP 组下降程度较少,α-SMA 无明显变化, COUP-TF1 表达上升。（3）体内实验：A、B组PVR 严重程度和病程进展相似，。实验组出现增殖条索后，病程进一步发展时数目明显减少。PVR分级显示，造模后A组与C组相比差异有统计学意义；造模 28d 后病理切片显示，A、B组可见视网膜水肿增厚，表面增殖膜牵拉视网膜脱离，视网膜结构紊乱，细胞层次不清，炎症细胞浸润；C组视网膜结构较整齐，表面少量增生膜及炎症细胞，未见视网膜脱离。造模 28d 后，发现与空白对照组和阴性对照组相比，实验组COUP-TF1表达下降。