Rac1调控PDGFRα信号通路在增生性玻璃体视网膜病变中的作用及机制

The studies have confirmed that epithelial mesenchymal transition (EMT) of retinal pigment epithelium (RPE) cells is the pathological basis of proliferative vitreoretinopathy (PVR), the highly express platelet-derived factor receptor (PDGFR) alpha in RPE cells is the key factor of PVR formation. Our previous experimental results confirmed that Rac1/LIMK1/cofilin signaling pathway mediates vitreous-induced RPE cell EMT process, but whether Rac1 is involved in modulating PDGFR alpha activation-induced PVR is still not clear. This project focuses on the role and mechanism of Rac1 regulated-PDGFR alpha signaling pathway in PVR. We take RPE cells as the research object, use the molecular biology technologies of RNAi technology, CRISPR/Cas9 gene editing, adeno-associated virus transfection and expression and immunoprecipitation to explore the role of Rac1-mediated PDGFR alpha signaling pathway on RPE cell biology function, and elucidate the molecular signal mechanism; Further establishing the PVR animal model to study and evaluate the role of Rac1 modulating PDGFR alpha signaling pathway in the formation of PVR in vivo. This project is expected to clarify the new pathogenesis of PVR and provide a theoretical basis for the establishment of a new treatment strategy.

研究已证实，视网膜色素上皮（RPE）细胞历经上皮间质转分化（EMT）是增生性玻璃体视网膜病变（PVR）的病理基础，RPE细胞高度表达血小板衍生因子受体（PDGFR）α是PVR形成的关键因素。申请人前期实验成果证实Rac1/LIMK1/cofilin信号通路调控了玻璃体诱导的RPE细胞EMT过程，但Rac1是否参与调控PDGFRα激活所致的PVR尚不清楚。本项目集中研究Rac1调控PDGFRα信号通路在PVR中的作用及机制，以RPE细胞为研究对象，利用RNAi技术、CRISPR/Cas9基因编辑、腺相关病毒转染表达及免疫沉淀等分子生物学技术探索Rac1调控PDGFRα信号通路对RPE细胞生物学功能的作用，阐明其分子信号机制；进一步建立PVR动物模型，体内研究和评价Rac1调控PDGFRα信号通路在PVR形成中的作用。本项目有望阐明PVR发病的新机制，为建立新的治疗策略提供理论依据。

前期研究已证实Rac1调控玻璃体诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞上皮间质转分化(EMT)这一过程。RPE细胞高度表达血小板衍生生长因子受体(PDGFR)β是增生性玻璃体视网膜病变(PVR)形成的关键因素，但Rac1是否参与调控PDGFRβ所致的PVR过程尚不清楚。本次研究拟以ARPE19细胞为研究对象，利用CRISPR/Cas9基因编辑、腺相关病毒表达载体及免疫共沉淀等分子生物学技术探讨Rac1与PDGFRβ间的相关性，阐明两者间分子信号调控机制。进一步解析该分子信号通路对RPE细胞生物学作用的影响。通过建立动物模型明确Rac1调控PDGFRβ信号通路在PVR形成中的作用。实验结果证明，ARPE19细胞受兔玻璃体刺激3h后，Rac1活性达到最高值，Rac1总表达量未发生变化；玻璃体刺激ARPEβ细胞Rac1活性明显增强，ARPE-KD细胞Rac1活性减弱；DOCK1与ELMO1敲除细胞系受玻璃体刺激后Rac1活性均受抑制；相差显微镜观察发现，普通培养组ARPE19、DOCK1/ELMO1敲除细胞保持扁平形态，细胞接触广泛；玻璃体液培养组ARPE19细胞一端呈扇形，另一端呈锥形拖尾形。DOCK1/ELMO1敲除细胞恢复扁平状态。免疫荧光结果显示，普通培养组肌动蛋白骨架分布于细胞周边部，玻璃体培养组肌动蛋白在ARPE19细胞一端重排，形成扁平状伪足突起，细胞另一端形成锥形拖尾，DOCK1/ELMO1敲除细胞肌动蛋白骨架重新分布于细胞周边部。普通培养组细胞生物学功能无明显差异，玻璃体培养组中，相较于ARPE19，DOCK1/ELMO1敲除细胞迁移及侵袭能力显著减弱，差异有统计学意义，但对细胞收缩作用不显著。玻璃体液培养组中T17N细胞增生、迁移、侵袭、收缩能力均减弱，差异有统计学意义。体内实验结果显示，注射Q61L组兔眼PVR程度严重，HE染色结果显示明显视网膜脱离，注射T17N组PVR严重程度减轻。本课题阐明了Rac1调控PDGFRβ信号通路在增生性玻璃体视网膜病变的发病新机制，为建立新的治疗策略提供理论依据。