双特异性磷酸酶9(DUSP-9)在肾细胞癌发生中的机制研究

Massively parallel sequencing studies have revealed the down-regulation of DUSP-9 in renal cell carcinoma. DUSP-9 negatively regulates members of the mitogen-activated protein kinase superfamily, which are associated with cellular proliferation and differentiation.The pre-experiment found that decreased expression of DUSP-9 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma.Although DUSP-9 have been found to be associated with renal cell carcinoma, the molecular mechanisms involved in the initiation and progression of renal cell carcinoma are still unclear. In this study, by immunohistochemistry, Western blot, methylation-specific PCR, in vivo experiments (colony-forming cell proliferation assay, Transwell chamber to detect cell migration, apoptosis Annexin V / PI double staining assay) and in vitro experiments (nude mice tumor), We clarify the occurrence of renal cell carcinoma development relationship, and epigenetic regulation mechanism in renal cell carcinoma.DUSP-9 may represent a novel and useful prognostic marker for renal cell carcinoma.

申请者在肾细胞癌临床大样本表达谱研究中筛选出一特异性基因DUSP-9。前期研究表明，DUSP-9负性调节有丝分裂激活蛋白激酶原的活性，与细胞的增殖分化相关，但与肿瘤发生发展机制不清。本研究预实验：通过临床样本数字表达谱筛查发现，DUSP-9蛋白在肾细胞癌中表达降低；通过临床样本验证和随访发现DUSP-9肾细胞癌预后相关。但是DUSP-9的低表达对肾细胞癌的作用机制不清楚。 本研究通过免疫组化、Western blot、甲基化特异性 PCR、体外实验（克隆形成实验检测细胞增殖、Transwell 小室检测细胞迁移、AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡）和体内实验（裸鼠成瘤）等方法和手段，阐明DUSP-9 基因表达降低与肾细胞癌的发生发展关系，及表观遗传的调控机制。从而系统探讨DUSP-9执行生物学功能的分子机理，为达到从该基因作用机制找肾细胞癌预后诊断与治疗新靶点的最终目标奠定基础。

肾细胞癌又称肾细胞癌，起源于肾小管上皮细胞，约占肾脏肿瘤的 90%。由于缺乏有效的早期诊断标志物，阻碍了对肾细胞癌的及时诊断，约四分之一的肾细胞癌患者在发现时已发生转移。因此，鉴定新的肾细胞癌特异性标志物进行肾细胞癌早期诊治的关键，这就需要对肾细胞癌发生发展的生物学有更好的理解。通过对中国人肾细胞癌的研究，我们鉴定出 23 个基因的突变与肾透明细胞癌具有显著的相关性，其中 12 个基因是新发现的包括（DUSP-9和PIK3R1等）。DUSP-9 属于双特异磷酸酶家族的膜蛋白之一，DUSP-9 能够负性调解有丝分裂激活蛋白激酶原的活性，与细胞的增殖和分化相关。DUSP-9 蛋白在肾细胞癌中表达降低，并且与肾细胞癌预后相关。而DUSP-9 低表达对肾细胞癌生长转移的作用机制如何？目前尚不清楚。前期研究表明，DUSP-9 负性调节有丝分裂激活蛋白激酶原的活性，与细胞的增殖分化相关，但与肿瘤发生发展机制不清。但是DUSP-9 的低表达对肾细胞癌的作用机制不清楚。.本研究通过研究表明：DUSP-9表达与肾癌的病理分级具有显著相关性，如性别、复发、临床病理分级、原发肿瘤-结节-远处转移分级、肿瘤大小，而与年龄无关。此外，运用CRISPR/Cas9 方法构建突变型PIK3R1 突变肾细胞癌细胞株，进行了细胞增殖、侵袭、与细胞干性等一系列的细胞功能试验，并验证通过PIK3/AKT/GSK3b/CTNNB1 信号通路进行了细胞功能的调控，并在裸鼠的动物模型上成功的进行了皮下成瘤，并进行了免疫组化、western-blot 等试验在动物模型上验证了PIK3R1 基因对肾细胞癌的调控。.本项目研究成果阐明肾癌发生发展的部分分子机制和相关调控通路，明确DUSP-9和PIK3R1 基因突变的在肾癌中的生物学功能，为后期临床应用和靶向药物设计提供分子靶点。同时也为该基因在其他肿瘤中的作用提供参考。