Crif1通过线粒体Stat3调控BMSCs辐射应激后线粒体再生的机制研究

The characteristics of low radiation sensitivity in BMSCs is of great significance in the treatment of bone marrow radiation syndrome, and mitochondrial regeneration which is mainly regulated by Stat3 is the main reason, but the specific mechanism is unclear. Our previous study found that expression level of Crif1 increased significantly and colocalized with Stat3 in mitochondria after radiation stress, moreover, mitochondrial regeneration also increased. mtDNA copy number was significantly reduced after radiation when Crif1 expression was inhibited in BMSCs, and resulted in obstacles of mitochondrial regeneration, decline of ATP production and mitochondrial number and increase of cell apoptosis. On this basis, we speculate that Crif1 may regulate BMSCs mitochondrial regeneration through mitochondrial Stat3 pathway and reduce the radiation sensitivity after radiation stress.In this project, we intend to first use immune coprecipitation to confirm interaction between Crif1 and Stat3 in the mitochondria; then intervene Crif1 expression level and prevent its mitochondria localization, RT-PCR, WB immunofluorescence and electron microscopic are used to observe the changes in mitochondrial structure and function; inhibitors and agonist are also used to study the mechanism of mitochondrial regeneration after radiation and its influence on BMSCs radiation sensitivity.

BMSCs辐射敏感性低的特性在骨髓辐射综合征救治中具有重要意义，以Stat3为关键调控分子的线粒体再生是其主要原因，但具体机制未明。我们前期研究发现，辐射应激后BMSCs表达Crif1水平显著升高并与Stat3线粒体共定位，线粒体再生增加；抑制Crif1表达显著降低辐射后BMSCs的mtDNA拷贝数，导致线粒体再生障碍、ATP产能及线粒体数量下降，细胞凋亡增加。据此，我们推测，Crif1可能通过线粒体Stat3途径调控BMSCs辐射应激后线粒体再生，从而降低其辐射敏感性。本项目拟首先采用免疫共沉淀明确线粒体内Crif1与Stat3的相互作用；然后干预Crif1表达水平及阻止其线粒体定位，通过RT-PCR、WB、免疫荧光、电镜等观察线粒体结构功能的变化；通过抑制剂和激动剂研究辐射后线粒体再生机制及对BMSCs辐射敏感性的影响。从而明确Crif1-线粒体Stat3在BMSCs辐射耐受中的机制。

线粒体是辐射损伤重要的靶细胞器，线粒体结构和功能的维持对BMSCs辐射后细胞存活和分化功能保持都具有重要意义。基于课题组前期研究发现，我们拟研究线粒体内膜结构蛋白Crif1通过对线粒体结构和功能的维持参与BMSCs辐射耐受的分子机制。原研究计划中，我们推测Crif1的靶分子为mitoStat3，但实际实验过程中我们发现Crif1主要通过上调ROS清除的关键分子SOD1和SOD2的表达降低BMSCs线粒体的辐射损伤。据此调整部分原研究计划，主要研究内容包括：BMSCs的分离鉴定和培养；Crif1敲除慢病毒载体构建；对Crif1表达调控后检测辐射后线粒体的结构、功能和ROS水平；探索下调Crif1导致的ROS升高的分子机制；检测下调Crif1表达对BMSCs辐射后成骨分化的影响；分析不同培养代数的BMSCs的辐射应激反应转录组特征等。.在完成根据实验结果做出调整研究计划的基础上，本研究取得下列研究结果：①Crif1定位于线粒体，Crif1的表达水平对辐射后线粒体ROS水平、ATP产生及线粒体膜电位都有重要作用；②敲除Crif1导致可辐射后细胞浆以及线粒体ROS水平升高，其机制主要与抑制SOD1和SOD2的表达直接影响ROS清除有关；③抑制和敲除Crif1可通过上调成骨分化关键基因Runx2促进BMSCs辐射后成骨分化；④不同培养代数的BMSCs具有不同的转录组特征，不同培养代数的BMSCs在辐射应激反应仍是经典模式，但在差异基因数量和辐射应激反应时间上存在明显差异。基于上述实验结果，我们初步明确Crif1的高表达在辐射后BMSCs的ROS清除中具有重要作用，而Crif1的低表达可促进辐射后BMSCs成骨分化；提示在遭受辐射后合适的时间窗抑制Crif1可促进BMSCs辐射后存活且保持其定向分化功能，从而促进造血微环境的恢复，为急性放射病的辅助治疗提供新的思路。同时，分析转录组测序结果提示，用于临床或科研BMSCs的培养代数也是其重要质控标准，培养代数对临床疗效或科研实验数据的可靠性都具有重要影响。