去泛素化酶BRCC36调控心脏成纤维细胞内Smad3信号通路的机制及意义

Cardiac fibrosis plays a critical role in the pathogenesis of diastolic cardiac dysfunction and is closely associated with the prognosis of patients. However, the specific and effective therapeutic medicine is still unavailable so far. Our more recent results have shown that activation of atrial natriuretic peptide (ANP)-cGMP-protein kinase G (PKG) pathway significantly enhanced the binding of Smad3 to a specifically cleaving Lys63-linked (K63) polyubiquitin deubiquitylating enzyme, BRCC36. Also, BRCC36 is significant down-regulated in the process of cardiac fibrosis induced by chronic pressure overload. However, the role of BRCC36 in the pathogenesis of cardiac fibrosis remain unclear. The present proposal will utilize cultured adult mouse cardiac fibroblasts (CFs) as a model and use various modern cell, molecular biological technologies and methods, including RANi, GST-Pull down, co-immunoprecipitation and in vitro deubiquitination assay etc, to clarify the structure basis of the binding between Smad3 and BRCC36; demonstrate the effect of BRCC36 in the negative modulation of anti-fibrotic ANP-cGMP-PKG pathway activation on pro-fibrogenic transforming growth factor-beta(TGF-β)/Smad3 signaling by targeting Smad3 deubiquitination; finally assess the role of BRCC36 in the pathogenesis of chronic pressure overload-induced cardiac fibrosis by using a novel transgenic mouse model of fibroblasts-specific over-expression of BRCC36. Collectively, the present project may provide new promising molecular targets and yield a novel therapeutic strategy for the prevention and treatment of pressure overload-induced cardiac fibrosis by specifically targeting Smad3 deubiquitylating enzyme.

心肌纤维化是导致舒张功能不全心衰、影响患者预后的一个重要因素，目前尚无特异性的有效治疗药物。我们近来证实，激活抗纤维ANP-cGMP-PKG通路可增强去泛素化酶BRCC36与Smad3的结合，而且在心肌纤维化时BRCC36表达可明显下调，但它在心肌纤维化发病机制中的作用并不清楚。本研究采用RNAi、免疫共沉淀等多种实验技术，旨在：1）从调节Smad3去泛素化修饰的角度阐明BRCC36是如何介导ANP-cGMP-PKG信号活化对心脏成纤维细胞内TGF-β/Smad3信号通路的抑制；2）揭示BRCC36与Smad3相互作用的结合位置；.3）最后利用成纤维细胞特异性过表达BRCC36新型转基因小鼠建立心脏慢性压力负荷模型，从整体角度揭示BRCC36在慢性压力负荷诱导的心肌纤维化中的作用。本研究结果有可能从调节特异性去泛素化酶来抑制纤维化的全新角度为心肌纤维化的防治提供新的思路和分子干预靶点。

心肌纤维化是导致舒张功能不全心衰、影响患者预后的一个重要因素，目前尚无特异性的有效治疗药物。我们近来证实，激活抗纤维ANP-cGMP-PKG通路可增强去泛素化酶BRCC36与Smad3的结合，而且在心肌纤维化时BRCC36表达可明显下调，但它在心肌纤维化发病机制中的作用并不清楚。本研究利用离体培养的成年小鼠心脏成纤维细胞以及心肌细胞特异性过表达BRCC36的转基因小鼠模型，采用RNAi、免疫共沉淀等多种实验技术进行研究。结果发现: TGF-β刺激不仅可促进Smad3磷酸化，也可同时增加BRCC36表达，诱导Smad3的K63位点的泛素化修饰，而转染腺病毒编码的BRCC36不仅可降低TGF-β诱导的Smad3的K63位点泛素化水平，还可有效抑制TGF-β诱导的Smad3磷酸化。相反，转染腺病毒编码的特异性BRCC37 shRNA敲除内源性BRCC36可进一步增加TGF-β诱导的Smad3泛素化修饰，但并不影响Smad3的磷酸化。以此同时我们还观察到，过表达BRCC36可有效抑制TGF-β诱导的Smad3入核、细胞外基质表达和心脏成纤维细胞增殖，而沉默内源性BRCC36则可增强TGF-β的促心肌纤维化效应。在体内，我们观察到主动脉缩窄诱导的慢性压力负荷不仅可导致促存活蛋白BCL-2，Mcl-1表达下调，同时促凋亡蛋白Bax明显上调。然而，在心脏细胞特异性过表达BRCC36转基因小鼠，心肌过表达BRCC36可显著增加BCL-2和Mcl-1的表达，抑制Bax的表达。有趣的是，我们还发现，持续的压力负荷可导致野生型小鼠心肌DNA损伤反应明显增加，表现为γH2AX表达水平明显升高，然而，心肌特异性过表达BRCC36则可显著抑制γH2AX的表达，同时增强心肌RAD51蛋白的表达水平，提示心肌DNA损伤修复能力得到了增强。更重要的是，心肌过表达BRCC36可显著改善慢性压力负荷诱导的心肌纤维化及重构。此外，与野生型小鼠相比，心肌过表达BRCC36可缩小冠脉结扎诱导的心肌梗死面积，减轻心肌细胞凋亡及心肌纤维化，改善心脏功能和心梗后的存活。这些研究结果提示，去泛素化酶BRCC36不仅可作为调控TGF-β-Smad3信号通路的重要因子，还可通过增强心肌DNA损伤修复能力参与慢性压力负荷诱导的心肌重构及心肌纤维化过程。