去泛素化酶BRCC36在心肌缺血再灌注损伤保护及梗死后重构中的作用

Repeatedly myocardial ischemia-induced cellular DNA damage and necrosis play a critical role in the pathogenesis of post-infraction heart failure. We recently found that the repair factor of DNA damage BRCC36, a deubiquitinase, not only negatively regulated transforming growth factor-β/Smad3 signaling, but cardiac-specific over-expression of BRCC36 effectively inhibited chronic pressure overload-induced myocardial DNA double strend breaks (DSB) formation and cardiac fibrosis. However, whether is BRCC36 involved in myocardial inflammatory response regulation during ischemia/reperfusion and cardiac remodeling post-infraction, it remains unclear so far. The present proposed project aims to address: 1) the effect and mechanism of BRCC36 on the inflammatory response in cardiomyocytes; 2) the effect of BRCC36 on oxidative stress-induced DSB formation in cardiomyocytes; 3) In vivo, we will ulitilize two transgenic mouse models (i.e. cardic-specific over-expression or knock-out of BRCC36 gene) to demonstreate the effect and molecular mechanism of BRCC36-mediated cardioprotection against ischemia/reperfusion injury and post-infraction advance cardiac remodeling. From the perspective of myocardial DNA damage repair, this study will contribute to provide for us new molecular target and therapeutic strategy to prevent adverse cardiac remodeling post-infarction.

反复缺血诱导细胞DNA损伤坏死以及不适当炎症反应是心梗后心力衰竭的重要机制。我们近来观察到，DNA损伤修复因子BRCC36去泛素化酶不仅可负性调节TGF-β/Smad3信号通路，而且心脏特异性过表达BRCC36基因还可显著抑制慢性压力负荷诱导小鼠心肌DNA双链断裂（DSB）形成，减轻心肌纤维化。但BRCC36是否参与心肌缺血再灌注损伤时心肌炎症应答调控及心梗后心室重构，目前国内外尚未研究。本项目使用乳大鼠心肌细胞以及心肌细胞特异性BRCC36基因过表达及敲除小鼠作为研究对象，试图阐明：BRCC36对心肌细胞炎症反应应答的影响及其机制；BRCC36对氧化应激诱导心肌细胞DSB形成的影响及其修复机制；最后在整体动物水平评价心肌特异性过表达/缺失BRCC36在缺血/再灌注损伤及心梗后心肌重构中的作用环节及机制，从心肌DNA损伤修复的角度为寻找心梗后心衰的防治策略提供新的思路和分子药物干预靶标。

急性心肌梗死后的病理性心肌重构可促进慢性心衰的发生。在临床上，如何改善慢性心衰的预后依旧是心血管病学界亟待解决的重大临床课题。在本项研究中，我们分离培养乳大鼠心肌细胞，1）给予IL-1β处理发现，IL-1β可诱导心肌细胞内NLRP3的K63位点的泛素化修饰水平降低，上调NLRP3及BRCC36表达，而过表达BRCC36可降低NLRP3 K63位点的泛素化修饰并增强IL-1β诱导的NLRP3的表达，相反，消减BRCC36则会明显增加NLRP3 K63位点的泛素化修饰水平。2）BRCC36也可促进LPS诱导的心肌细胞内NLRP3炎症小体的活化，促进Caspase-1前体的成熟，IL-1β和IL-18的释放，从而进一步促进促炎细胞因子TNFα、IL-6、IL-1及趋化因子MIP1α、MIP2和MCP1的表达。3）免疫共沉淀分析发现，心肌细胞内BRCC36可以与ATM及RAD51相互作用，BRCC36可以明显降低H2O2诱导的ATM、RAD51以及组蛋白H2AX的K63位点的泛素化修饰水平，促进受损心肌细胞ATM的激活，及早启动DNA损伤反应。4）相似的是，过表达BRCC36还可以明显抑制博来霉素、阿霉素以及IR诱导的心肌细胞DNA损伤，同时增加MRN复合物中MRE11的表达，而干扰BRCC36表达可以减少MRE11的表达，抑制DNA损伤的修复，因此加重心肌细胞IR诱导的DNA损伤。5）与野生型小鼠相比，心肌细胞特异性过表达BRCC36可明显促进心脏组织中Mcl-1、P-Bad、Bcl-2的表达，抑制Puma、caspase-3 的表达，减轻心肌的凋亡，同时抑制DNA损伤标志物γH2AX的表达，促进DNA损伤修复因子RAD51的表达。6）心肌细胞特异性敲除BRCC36则导致心肌梗死面积增大，心肌纤维化程度加重，心肌细胞凋亡增多，明显增加γH2AX的表达，降低RAD51表达，加剧心梗后心脏功能不全，降低心梗后生存率。10）敲除BRCC36可以加重慢性压力负荷诱导的心肌细胞肥厚，加重心肌负性重构和心衰。该项研究证实，BRCC36参与了急性心肌梗死早期心肌细胞炎症反应应答的调控，通过减轻心肌细胞DNA的损伤反应，增强DNA损伤的修复能力，从而来改善病理性心肌重构过程，从而有助于预防慢性心力衰竭的发生。本项目从增强心肌DNA损伤修复的角度寻找到了预防心梗后心衰的分子药物干标。