转化生长因子-β抑制心脏成纤维细胞过氧化物酶增殖物激活受体γ表达的转录调控机制及其病生理意义

心肌纤维化是导致舒张功能不全心衰并影响患者预后的一个重要因素，目前尚缺乏有效的药物治疗。我们新近观察到，转录性抑制PPARγ表达可能是TGF-β促心肌纤维化的一个新机制，但这种转录抑制的具体分子机制并不清楚。本研究通过对已有的PPARγ启动子报告质粒的系列突变，结合双萤光素酶报告基因分析，凝胶迁移率及抗体超迁移实验、染色质免疫沉淀分析（ChIP）等技术方法，试图阐明：1）介导PPARγ转录下调关键的启动子片段大小以及转录因子Smad结合元件的序列及位置；2）明确与PPARγ启动子结合的Smad亚型以及与其它转录调节因子在PPARγ启动子区相互作用的时空关系；3）探讨PPARγ表达下调增强TGF-β促纤维化效应的具体作用环节。基于PPARγ激动剂在心衰患者临床应用的局限性，本研究将为研发修复慢性压力负荷下PPARγ表达下调这一内源性保护机制的新型抗纤维治疗策略提供新的分子药物干预靶标。

本项目研究探讨TGF-β/Smad信号通路抑制PPAR的表达的分子机制。我们利用培养小鼠CFs，1）证实了TGF-β1处理本身并不改变PPARγ mRNA的半衰期；2）利用萤光素酶报告基因技术确证了在TGF-β1刺激下，Smad3是介导TGF-β1抑制PPARγ转录的关键分子；3）进而利用PPARγ启动子全长质粒分别构建不同长度片段的PPARγ启动子质粒，明确了在PPARγ启动子上-1.8kb至-1.3kb期间含有了Smad3 的结合序列，缺失该片段可基本废除TGF-β1诱导PPARγ转录抑制；4）利用ChIP技术对Smad3相关的转录辅阻遏因子进行了筛选，证实了在TGF-β1刺激下，转录辅阻遏因子mSin3A与PPARγ基因启动子的结合显著增加；5）随后利用转染慢病毒携带的mSin3A shRNA特异性敲出内源性mSin3A后，发现沉默mSin3A可显著抑制TGF-β1对PPARγ基因的转录抑制；6）利用DNA亲和沉淀分析，证实了在TGF-β1刺激下，在PPARγ启动子上可有效形成Smad3-HDAC1-mSin3A转录抑制复合体；7）在体内，预处理特异性PPARγ拮抗剂T0070907可进一步加重慢性压力负荷诱导的心肌纤维化，并增加左室舒张末期压力；8）在体外，过表达PPARγ在无需PPARγ配体的情况下即可有效抑制TGF-β1诱导的细胞外基质的生成，相反，转染PPARγ shRNA腺病毒有效抑制内源性PPARγ基因后则可显著增强TGF-β1诱导的细胞外基质的生成。这些结果说明，PPARγ可发挥对TGF-β1促纤维效应的对抗调节作用，其表达水平及活性在慢性压力负荷诱导的心肌重构过程中发挥着十分重要的作用。 . 本项目自实施以来，先后顺利培养2名硕士研究生毕业，发表专业学术论文7篇，其中SCI收录5篇，ISTP1篇，国内核心期刊2篇，另外1篇SCI论文正在投稿修改中。项目主持者本人内先后被评为江苏省第四期科教兴卫”医学重点人才培养对象，省第四期333工程人才培养对象，江苏省好青年百人榜，江苏省卫生系统青年岗位能手，当选为中国病理生理学会心血管专业委员会青年委员以及江苏省心血管专业委员会青年委员，先后获得了江苏省第四期333高层次人才培养工程项目资助以及一项国家自然科学基金面上项目资助。因此，本项目截止目前基本完成了该研究计划，取得了很好的预期研究成果。