奶牛瘤胃高效产氨菌菌群结构及其功能研究

Ruminants have an average N utilization efficiency of around 25%, and the rapid amino acids deamination by ruminal hyper ammonia-producing bacteria (HAB) is one of the main causes for the low N utilization efficiency. Unfortunately, little knowledge is known about the community structure and functional characteristics of HAB. In this project, subculture method combined with 16S rRNA clone library and PCR-DGGE techniques are employed to investigate the community structure of HAB in dairy firstly. Then, anaerobic culture technique are utilized for enrichment, isolation, purification and screening of high activity ammonia-producing bacteria. Conventional biochemical combined with molecular biology techniques are employed to identify the isolated HAB, and determine their taxonomic status, ammonia-producing ability and functional characteristics. Based on the 16S rRNA gene sequences of HAB, species-specific primers are designed for development of a rapid quantitative PCR assay. Lastly, an in vivo experiment is designed using rumen-fistulated animals to investigate the relationship between rumen HAB community structure, ruminal ammonia concentration and total N utilization efficiency under different nitrogen sources, and to evaluate the effects of inhibitor on HAB population and ruminal ammonia utilization efficiency. The objectives of this study are to elucidate the community structure and functional characteristics of HAB, which will provide theoretical basis for the manipulation of ruminal N metabolism, the improvement of N utilization efficiency in ruminants.

反刍动物氮平均利用率仅25%左右，而瘤胃中高效产氨菌（HAB）产氨速率过快，是导致氮利用率低的主要原因之一，但HAB菌群结构与其脱氨基功能特性尚不清楚。本项目拟首先采用体外继代培养法，结合16S rRNA基因克隆文库、PCR-DGGE等分子技术，分析奶牛瘤胃HAB菌群结构；而后利用厌氧分离手段，对瘤胃HAB菌群进行富集、分离、纯化和筛选，利用常规生化和现代分子生物学技术鉴定所筛选出的HAB菌株，确定其分类地位、产氨能力与功能特性；在此基础上，设计特异性引物，建立快速检测HAB数量的Real-time PCR方法；最后，设计安装有瘤胃瘘管的动物试验，研究不同氮源情况下瘤胃HAB菌群结构、瘤胃氨浓度与机体对氮总利用率之间的关系，以及评价HAB抑制剂对瘤胃HAB数量及瘤胃内氨总利用率的影响。研究结果可阐明HAB菌群结构与其脱氨基功能特性，为调控反刍动物瘤胃氮代谢和提高氮利用率提供理论依据。

对于反刍动物来说，氮的平均利用效率仅为25%左右，绝大部分无效氮随粪尿排出体外。氮素的大量流失不仅造成饲料蛋白质资源浪费，而且加剧环境污染。而反刍动物瘤胃中高效产氨菌（HAB）产氨速率过快，是导致反刍动物氮利用率低的主要原因之一。为了对奶牛瘤胃HAB结构和功能进行研究，本项目首先建立了对瘤胃两种高效产氨菌（斯氏梭菌和嗜胺梭菌）的Real-time PCR检测方法，并有效应用到了后续体外和体内试验当中；其次，通过体外富集试验研究了不同氮源组成对奶牛瘤胃氨生成与蛋白降解菌菌群结构的影响，研究发现消化链球菌属（Peptostreptococcus）中特异性高效产氨菌的存在可能是造成瘤胃脱氨基产氨速率过快的主要原因，此外，通过后续的分离和纯化，分离出了一株HAB，并对其代谢特性进行了初步研究；然后，通过体外发酵试验研究了不同抑制剂对瘤胃体外发酵、氨生成及微生物菌群的影响。研究结果表明，适宜浓度的乳酸链球菌素（3 mg/100 mL）、杆菌肽与杆菌肽锌（1 mg/100 mL）和溶菌酶（1 mg/100 mL）均可在不影响饲料消化的条件下，降低瘤胃氨的生成，增加丙酸浓度以及降低乙丙比；最后，通过体内试验研究了不同氮源日粮条件下添加乳酸链球菌素对生长湖羊生长性能、氮代谢及微生物菌群结构的影响。研究结果表明使用干酒精糟及其可溶物（DDGS）替代豆粕可减少尿氮排放而不影响湖羊生长性能及瘤胃细菌菌群结构，但日粮添加乳酸链球菌素对湖羊生长性能、氮代谢及微生物菌群结构均无影响。本项目研究结果为调控反刍动物瘤胃氮代谢和提高氮利用效率提供了科学依据。