循环肿瘤细胞捕获与原位功能分析新技术研究

Cancer is one of the main diseases to human health. The capture and analysis of circulating tumor cells (CTCs) is the most innovative and transformational potential method for early diagnosis of cancer. CTCs are sparsely and highly heterogeneous in the peripheral blood. In the early period when tumor cell phenotype is not apparent, there are some pathogenic phenotype exhibited in the CTC , which play an important role as a prognostic and predictive marker. Traditional methods for CTCs capture analysis have some limitations, such as the difficult to achieve single-cell functional typing and to be coupled with other single-cell functional analysis technology. Thus, it is necessary to single-cell functional analyze captured CTCs. In this project, A new microfluidic chip-based technology for capture and single-cell functional analysis of CTCs will be established for early diagnosis of cancer. microfluidic chip with micro-wells array and immune magnetic beads are used to profiles CTCs on the basis of their surface expression phenotype during capture. Based on relatively independent and interoperable environment of micro-wells and high operability of microfluidics, the in situ invasion analysis, multiple gene expression and mutation detection of a single CTC are performed. The project has great scientific senses and clinical value in monitoring of tumor recurrence, antitumor drug evaluation and treatment of cancer disease.

恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一，循环肿瘤细胞（CTCs）的捕获与检测是目前最具创新性和转化潜力的肿瘤早期诊断新方法。CTCs数目稀少，具有高度异质性。在疾病发展的极早期，个别CTCs中已出现一些典型的遗传学以及表型差异，从而最终形成恶性肿瘤。因此CTCs的单细胞功能异质性分析非常重要。已有的捕获方法难以实现CTCs的单细胞功能分型，且无法同其它单细胞分析技术无缝偶联。本项目提出肿瘤循环细胞的分型捕获与原位单细胞分析新技术研究：基于微孔阵列芯片中的流体微尺度效应，结合免疫磁珠实现CTCs的高效单细胞分型捕获；利用芯片内相对独立而又互通的微环境以及微流体的高度可操作性，原位实现单个CTC的侵袭分析、多基因表达与突变检测以及药敏评估，极大提高CTCs的单细胞异质性分析的灵敏度与效率，建立肿瘤早期诊断新方法。本课题可为药物筛选、个体化诊疗等提供创新性技术平台支撑，有助于学科交叉与人才培养。

CTCs细胞与肿瘤的发生、发展和转移密切相关。已证实CTCs细胞在多种恶性肿瘤患者的血液中能够被检测到，其表面抗原、生理以及特定基因的表达可作为早期癌症诊断的标志物。因此，高灵敏检测CTCs单细胞表面糖蛋白以及及基因转录对于实现癌症早期诊断至关重要。. 本项目提出了基于微孔阵列的CTCs单细胞表面抗原定量分析新方法。微气泡具有非常显著的折射与反射光学特性，且气泡的体积与它的质量比大。为了实现高灵敏度检测，我们通过固定化的微气泡进行检测细胞表面抗原。利用微孔阵列芯片捕获并固定CTCs单细胞，通过适配体，细胞表面的目标蛋白MUC1被标记上铂纳米颗粒。使用铂纳米颗粒催化H2O2产生的亚毫米大小的微泡来可视化单细胞表面的蛋白质抗原MUC1。通过明场显微镜以及CCD记录气泡的大小与数量以及产生的速度。从而实现对单细胞表面抗原的定量化分析。利用该微气泡检测系统，实现了对多种肿瘤细胞系的不同MUC1表达量的定量分析。可见，该技术平台能通过气泡密度、数量以及大小对不同肿瘤阶段的CTC细胞进行捕获与分型。. 本项目还成功建立了可用于单细胞的检测与分选的液滴微流控芯片。利用微流控技术将含有检测材料的凝胶微球同细胞共包裹在液滴，从而可实现单细胞的检测与分析。建立了基于正压的水力门控的新技术，可利用气体压力推动流体在芯片内形成门控状态，可以精确控制原来的流体的方向，还可直接在油相中按需生成大小可控的液滴。该水力门控具有操作简单、花费少、操纵性高、易于同其它液滴微流控芯片系统整合等优势。进一步建立了正压介导的水力门控与液滴共包裹的整合芯片，通过偶联凝胶微球共包裹液滴的生成与分选，实现了微量荧光细胞检测、富集与功能分析的一体化。. 本课题有助于深入了解癌症的发生与转移的机理，为医学工作者提供新的癌症治疗参考，还可为药物筛选以及个体化医疗等领域提供方法以及创新性平台支撑。并促进生物化学、生物医学及其交叉学科的发展和人才培养。