肿瘤杀伤SET蛋白复合体的鉴定、功能与结构研究

我们表达纯化了具酶活性颗粒酶K及突变失活的颗粒酶K，研究发现颗粒酶K介导不依赖于Caspase的杀伤途径。还发现颗粒酶K能水解DNA酶NM23H1的抑制剂SET，具核酶活性的NM23H1发生核转位，导致染色体DNA的单链断裂。为了鉴定颗粒酶K的作用底物，将突变失活的颗粒酶K与基质制成层析柱，通过柱层析技术，分离了与颗粒酶K作用的SET蛋白复合体，大小在500kD左右，其中含有SET和pp32。 本课题将进一步鉴定SET复合体的其它组分，并利用串联亲和纯化技术对SET复合体进行验证。探讨SET复合体在基因转录和DNA修复中的作用。探明SET复合体发生核转位的分子机制。还将利用冷冻电镜技术对SET复合体进行三维结构重构，测定SET复合体的结构，以期探明SET复合体的结构与功能的关系。我们并将深入探讨GzmK与A攻击SET复合体的异同，阐明颗粒酶K与A在细胞杀伤中的精细调节作用。

肿瘤杀伤蛋白颗粒酶介导的靶细胞凋亡是机体抗病毒和抗肿瘤的主要免疫效应途径。我们研究发现颗粒酶K介导快速不依赖于Caspase活化的杀伤途径。我们分离并鉴定了SET复合体各组分，包括SET、HMG2、APE1、Trex1、pp32、VCP、p53、Imp alpha1、Imp beta、PP2A、WASH、Pcid2等。这些组分主要包括：负责基因转录功能（如SET、HMG2、pp32等）；负责细胞周期调控和DNA修复功能（如APE1、Trex1、p53等）；以及负责蛋白质修饰和核转移（如Imp alpha1、Imp beta、PP2A等）；还有功能尚未确定的新蛋白WASH和P2等。我们发现SET复合体能与组蛋白H3结合，可抑制组蛋白H3 N末端Ser10和Ser28磷酸化修饰。我们发现SET复合体含有磷酸酶PP2A的活性，通过招募PP2A调节组蛋白H3的磷酸化，提示SET复合体在基因转录调控中发挥重要作用。我们还发现SET复合体在细胞受到应激或颗粒酶攻击的情况下，能发生由胞质到胞核的核转移等功能。我们确定了SET复合体中颗粒酶K的作用底物，包括SET、HMG2、APE1、VCP、p53、Imp alpha1、Imp beta等,以及非颗粒酶K的生理底物。颗粒酶K通过水解其生理底物，导致细胞凋亡。我们证实颗粒酶K水解SET、HMG2、APE1等，导致DNA核酶NM23H1释放及DNA修复的破坏；水解VCP，破坏了ER介导的错误折叠蛋白的水解，导致ER应激；水解p53使其形成3分子片断，皆具促凋亡作用；水解Imp alpha1及Imp beta核转运复合体，阻止了重要病毒蛋白的入核，从而阻断病毒DNA的复制。发现WASH具有抑制细胞自噬的作用，主要通过招募RNF2降解E3 连接酶Ambra1，从而抑制Vps34的活性阻止自噬小体的形成。发现Pcid2在ES细胞自我更新中发挥重要作用，Pcid2通过与EID1的E3连接酶Mdm2竞争结合底物EID1，致使EID1不被降解，从而抑制了p300的HAT活性，继而阻断了分化相关基因的转录，从而维持ES细胞干性。还发现颗粒酶M及颗粒酶H不能攻击SET蛋白复合体，它们通过作用于其特定的底物发挥杀伤作用，解析了颗粒酶M、颗粒酶H及其与底物复合物的晶体结构，阐述了其发挥作用的结构基础。通过该项目的完成，加深对免疫活性细胞杀伤肿瘤机制的认识