颗粒溶素抗肿瘤作用研究

颗粒溶素是NK/CTL细胞细胞毒颗粒的重要蛋白，已报道能杀灭胞内多种病原体，具有广谱的抗菌作用。低浓度的颗粒溶素还具有趋化及促炎症作用,而高浓度的颗粒溶素还能直接杀伤肿瘤细胞。但对颗粒溶素引起的肿瘤细胞死亡的特征及死亡的确切分子机制尚未阐明。我们实验室已成功表达纯化了具有活性的颗粒溶素，研究表明颗粒溶素引起的细胞死亡不具典型的凋亡特征。还发现颗粒溶素引起的细胞死亡过程中，Bid蛋白被切割活化。溶酶体参与了颗粒溶素介导的细胞死亡。在此基础上，我们将深入探讨颗粒溶素引起细胞死亡的特征及确切的分子机制。探究颗粒溶素是否协同穿孔素介导颗粒酶进入肿瘤细胞诱发细胞凋亡，探明其协同作用的分子基础。并且建立肿瘤模型，构建将颗粒溶素导入体内的腺病毒载体或构建颗粒溶素与特异性肿瘤高表达抗原对应抗体的融合蛋白的抗体靶向药物，研究颗粒溶素有效导入肿瘤部位的途径及其抗肿瘤治疗效应，为其用于肿瘤的免疫治疗提供理论基础

颗粒溶素属于脂结合蛋白SAPLIP家族，颗粒溶素和穿孔素联合使用可以杀灭很多细胞内的病原体。然而对颗粒溶素的抗肿瘤作用尚未阐明。我们已成功表达纯化了具有活性的颗粒溶素，研究表明颗粒溶素引起的细胞死亡不具典型的凋亡特征，没有典型的核浓缩及DNA 双链断裂。我们定义为颗粒溶素介导的是一种介于典型凋亡和典型坏死之间的坏死型凋亡（necropotosis）。颗粒溶素作用于肿瘤细胞后，发现与凋亡有密切关系的蛋白Bid被切割，并且组织蛋白酶Cath B 的抑制剂及下调表达Cath B都抑制了颗粒溶素引起的Bid减少，说明释放至胞浆的Cath B切割了胞浆中的Bid。Bid野生型细胞比Bid敲除细胞对颗粒溶素更为敏感。因此，颗粒溶素导致溶酶体中组织蛋白酶Cath B的限量释放，表明溶酶体参与了颗粒溶素介导的细胞死亡。我们研究表明颗粒溶素能进入肿瘤细胞溶酶体并使溶酶体中的Cath B逐步释放至胞浆，释放至胞浆的Cath B会切割胞浆中的Bid形成tBid，tBid破坏线粒体膜，促使Cyt.c及AIF等从线粒体中释放出来，引起细胞凋亡。我们还发现颗粒溶素与颗粒酶M具有协同促进肿瘤细胞凋亡的作用，因此，也探究了颗粒酶M介导肿瘤细胞凋亡的机制。发现颗粒酶M引起的细胞凋亡能被caspase抑制剂所抑制。在颗粒酶M引起caspase的级联活化过程中，caspase-3、caspase-8和caspase-9都被活化。证明caspase-8在颗粒酶M介导的caspase级联活化过程中发挥了起始者的作用。颗粒酶M能够切割FADD形成tFADD，切割位点是196位的甲硫氨酸。tFADD自身具有很强的相互作用，能形成比全长的FADD更加高聚的结构。而这种聚集的tFADD能够活化caspase-8，从而介导了颗粒酶M引起的caspase依赖的细胞凋亡。IAP家族成员Survivin与XIAP等是caspase的生理性抑制剂, 我们发现颗粒酶M能够切割Survivin，Survivin的水解促进了Survivin-XIAP复合体的降解，从而释放了caspase的活性。通过上述研究，我们揭示了颗粒溶素引起细胞死亡的特征及确切的分子机制，并探明了其协同作用的颗粒酶M介导肿瘤细胞凋亡的分子机制，这些机制的揭示将为肿瘤的免疫治疗提供理论基础。