壳寡糖抑菌过程中差异蛋白质组分析及蛋白质氧化损伤研究

壳寡糖在果蔬贮运保鲜领域具有广阔的应用前景，阐明其抑菌机理将对其在病害防治方面的应用提供关键的理论依据和指导作用。目前关于其抑菌机制的研究多集中在壳寡糖对微生物细胞壁和细胞膜的直接破坏作用，而对其抑菌过程中所涉及的系列生化代谢过程缺乏系统探讨。蛋白质组学研究可在全蛋白水平上揭示细胞对生物和非生物因子的响应机制，而且已证实是壳寡糖生物学功能研究的一项非常有效的技术手段。本项目拟采用差异蛋白质组学研究方法，解析壳寡糖引起的Escherichia coli和Botrytis cenerea孢子细胞胞外蛋白质、质膜和线粒体膜蛋白质、胞内总蛋白质的动态变化及差异蛋白质基因表达；结合免疫杂交揭示蛋白质的氧化损伤及损伤蛋白质全貌；重点阐明壳寡糖处理引起的蛋白质分子的差异表达和功能损伤的动态变化规律，并分析其在生理代谢途径中的作用，为阐释壳寡糖的抑菌机理提供蛋白质水平上的实验依据和基础。

关于其抑菌机制的研究多集中在壳寡糖对微生物细胞壁和细胞膜的直接破坏作用，而对其抑菌过程中所涉及的系列生化代谢过程缺乏系统探讨。蛋白质组学研究可在全蛋白水平上揭示细胞对生物和非生物因子的响应机制，而且已证实是壳寡糖生物学功能研究的一项非常有效的技术手段。利用蛋白质组学技术对壳寡糖抑制灰霉孢子萌发过程中蛋白质变化进行研究，经过双向电泳共分离得到1061个蛋白点，对其中28个差异蛋白点通过一级和二级质谱鉴定，成功鉴定出21个蛋白点，这些蛋白点分属于18种蛋白质，其中在壳寡糖处理后14个蛋白表达量下调，4个蛋白表达量上调。蛋白功能主要包括物质代谢、蛋白质合成、蛋白质折叠、蛋白质水解和信号传导等。其中，壳寡糖处理组与对照组相比，表达下调的蛋白数量显著多余上调的蛋白数量，除去未知功能的蛋白外，经过壳寡糖处理后，灰霉胞内蛋白差异表达变化显著的多与蛋白质合成，尤其是蛋白合成后折叠有关。因而推断，壳寡糖的处理不仅降低了灰霉孢子内蛋白的合成，而且干扰了蛋白质的进一步折叠加工，使细胞内部积累了大量错误折叠的蛋白，从而促使细胞内部的正常代谢出现紊乱。0.5%和1%的壳寡糖显著抑制了大肠杆菌的生长，通过测定大肠杆菌碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶和β-半乳糖苷酶等胞内酶的外泄情况及流式细胞仪测定表明壳寡糖主要是诱导凋亡发生，引起胞内质膜、蛋白质和DNA的氧化损伤。在0.5%和1%壳寡糖处理下，通过蛋白质组分析、差异点质谱分析，壳寡糖处理组与对照组相比有28个蛋白点表达量上调，有10个蛋白点表达量下调，上述蛋白主要参与物质代谢、蛋白质合成和氧化还原，其中与氧化还原相关的蛋白质全部上调，物质代谢相关蛋白质和蛋白质合成相关蛋白大部分上调。壳寡糖具有抑菌性，静止培养中5，10 g/L壳寡糖可明显促进菌体生长，但抑制了毒素的分泌；静止培养和摇床培养实验中，相同浓度的壳寡糖在4，16，25 ℃培养条件下对菌体生长的影响存在差异，但是均抑制了毒素分泌；不同温度培养条件下，扩展青霉单位菌体产毒量的大小按培养温度排序为16，4，25 ℃。因此将壳寡糖用于果蔬采后病害控制时需要注意贮藏的温度对毒素分泌的影响，以期达到抑菌效果和食用安全性。该项目研究揭示了壳寡糖抑菌过程蛋白质层面的变化，为进一步解释其抑菌机理提供依据和思路。