基于分子标记的壳聚(寡)糖抑制果实病原真菌机理研究

壳聚糖具有广谱的抑菌性，不同分子特征和浓度的壳聚糖可能存在不同的抑菌模式，但目前对其抑菌机理缺乏系统研究。生物和非生物逆境因子可直接导致细胞结构、质膜、蛋白质和核酸分子的损伤，也可通过系列信号途径间接引起细胞程序性死亡或受损，导致细胞最终丧失正常的生理功能或死亡。活性氧(ROS)介导的细胞程序化死亡或凋亡过程已被证实在多种生物和非生物因子诱导的酵母细胞响应和凋亡过程中起到关键作用。ROS参与壳聚糖的抑菌作用最近已有报道。基于目前研究背景，项目提出以两种分子、两个浓度的壳聚(寡)糖为材料，以完整灰霉孢子和脱壁的原生质体为研究对象，从作用位点，对质膜透性、完整性和功能状态的影响，ROS动态，细胞凋亡和生物大分子的损伤等角度研究其对病原真菌的抑制效果与上述过程或指标间的内在规律，以揭示壳聚(寡)糖抑菌机理。项目顺利实施对阐明壳聚(寡)糖抑菌功能具有一定理论意义,对其应用研究具有指导作用。

壳聚糖及壳寡糖是带有正电荷的物质，具有多种生物学功能，其中广谱的抑菌性近年来备受关注。本项目以特定的分子量的壳聚糖和壳寡糖系统研究了对多种果蔬病原真菌的抑菌规律。在此基础上以番茄灰霉病菌（Botrytis cenerea）孢子为研究对象，采用0.5 g mL-1和5 g mL-1的壳聚糖或壳寡糖分别处理，详细研究了两种外源物质处理对灰霉孢子萌发的影响。采用荧光物质标记的方法，观察了壳聚糖或壳寡糖处理对灰霉孢子细胞质内ROS动态变化的影响规律；采用生化测定方法，定量分析了上述处理过程中灰霉孢子膜质过氧化损伤、蛋白质羰基化和硝基化损伤、核酸物质损伤以及细胞凋亡的情况；采用差异蛋白质组学方法，分析鉴定了壳寡糖处理引起灰霉孢子蛋白质差异表达的概况。同时在壳聚糖和壳寡糖处理时，通过外源同时添加H2O2、Vc和CAT物质以增加或减弱ROS动态变化，定性和定量地分析了壳聚糖或壳寡糖处理对胞内ROS变化的影响以及所引起的膜质过氧化损伤、蛋白质羰基化和硝基化损伤、核酸物质损伤以及细胞凋亡的变化。项目研究结果说明壳聚糖特别是壳寡糖处理可引起灰霉孢子细胞质ROS的积累，进而导致胞内膜脂、蛋白质、核酸等生物大分子的损伤，诱导细胞凋亡，最终导致孢子细胞不能正常萌发。目前关于壳聚糖和壳寡糖抑菌机制主要观点是：壳聚糖和壳寡糖作用于微生物细胞壁和细胞膜，破坏其细胞壁和细胞膜，干扰正常的物质运输和引起胞质渗漏，导致微生物的死亡；本项目研究的主要贡献在于从细胞和生理角度揭示了壳聚糖和壳寡糖作用与灰霉孢子细胞，通过ROS介导的胞内损伤引起孢子细胞凋亡和死亡，上述研究结果也获得近三年的文献报告的印证，为阐释壳聚糖和壳寡糖的抑菌机制提供新实验依据。项目研究已在在国际主流期刊发表SCI收录论文3篇，国内核心期刊3篇，作为副主编出版学术专著1部，培养硕士研究生7名。