非编码核酸TAS1干扰植物抗热基因的分子机制

In the model plant Arabidopsis, non-coding nucleotide TAS1 silence thermotolerance gene HTT1. However, the ta-siRNAs derived from TAS1 do not show such silenceing under heat shock. We suppose that heat shock changes RNA interference of ta-siRNAs to the target genes. This proposed project will analyze genetic mechanism underlying RNA interference of thermotolerance genes. We will choose the mutants deficient in ta-siRNA biogenesis, overexpress TAS1 or ta-siRNA and examine the effects of heat shock on expression of thermotolerance gene and thermotolerance of plants.some mutants deficient in RNA-dependent methylation will be used to investigate the effects of TAS1 or ta-siRNA on methylation of thermotolerance gene. To understand the effects of high and extremely high temperature on the activities thermotolerance gene, in vivo and in vitro detection of the efficiency for double-stranded RNA production will be performed. We will mutagenize the TAS1 gene for the selection of the domains and key nucleotides that play important role in thermotolerance. We will explore the molecular mechanism underlying RNA interferance to thermotolerance, and thus advance the theory of RNA interferance and plant thermotolerance.

在模式植物拟南芥中，非编码核酸TAS1沉默抗热基因HTT1。但是，来源于TAS1的ta-siRNAs在热激条件下却没有这种沉默作用。我们推测，热激改变了ta-siRNA对靶基因的干扰作用。本课题将分析TAS1和ta-RNA干扰抗热基因的遗传机制。我们将选择小RNA生成有缺陷的突变体，通过TAS1的过量表达，了解TAS1和ta-siRNA在热激条件下对抗热基因表达和植株抗热性的影响；利用依赖RNA的甲基化突变体，考察内源TAS1或ta-siRNA对抗热基因甲基化的影响；在体内外测定TAS1或小RNA与靶基因mRNA在高温下形成双链RNA的效率，了解高温和极端高温影响TAS1或小RNA活性的原理；对TAS1基因进行缺失和定点突变，发现那些在TAS1和ta-siRNAs序列上对抗热基因表达起关键作用的区域或核苷酸，明确TAS1干扰抗热基因的机制，为发展RNA干扰和植物抗热性的理论提供科学依据。

高温、干旱、低温以及盐渍等非生物胁迫对全球作物产量造成了严重地损失。尤其是近年来全球气候变化带来的频繁高温胁迫，严重影响了植物的生长发育和作物产量，这也是农业发展所面临的紧迫问题。为了探究TAS参与调控的高温胁迫响应途径中的其它因子，我们着重分析了hsfA1a/1b双突变体幼苗在热处理(37°C)后的基因表达谱芯片数据。结果发现At4g29770和At5g18040两个基因在野生型中受高温诱导非常明显，但在hsfA1a/1b双突变体中则不然。通过对高温耐受型的HsfA1a过表达转基因株系进行分析，发现At4g29770和At5g18040的表达受到HsfA1a的诱导，并且这种诱导效应在高热处理后表现尤为明显。进一步的实验表明HsfA1a可以直接激活这两个基因的转录。At4g29770和At5g18040编码两个功能未知的蛋白，并在转录后水平被TAS1产生的ta-siRNA（ta-siR255）靶向剪切。为了检测HTT1和HTT2是否在高温胁迫响应中发挥功能，我们分别构建了功能缺失和获得的转基因株系。在TAS1a和 MIR173共同过表达的转基因株系中，ta-siR255 积累量显著提高，并且导致转基因植株高温耐受性降低。相反的，过量表达HTTs基因不仅显著地提高了转基因植株的高温耐受能力，还诱导了部分Hsf基因的表达。综合起来，我们的研究结果发现ta-siR255的靶基因HTT1和HTT2在转录水平受到HsfA1a的激活，同时在蛋白水平HTT1作为共作用因子与Hsp70-14等形成复合体发挥功能。我们的研究通过解析HTTs的生物学功能，揭示了HsfA1a、TAS、HTTs参与高温胁迫响应的分子机制，同时可望应用于作物的抗高温分子育种。