HYL1在细胞质中参与miRNA前体加工的新途径

HYL1是一个双链RNA结合蛋白，能够与DCL1，SE等蛋白形成复合体，负责miRNA前体的加工。亚细胞定位的实验表明，植物miRNA前体的加工是在细胞核内进行的。但是，这种认识还缺乏足够的生物化学证据。申请者在拟南芥核糖体中意外地发现HYL1一个短的N-端蛋白变异体。这个缺少核定位信号的N端蛋白定位在细胞质中，可能在细胞质中也参与miRNA的生物合成。为了澄清 N端蛋白的这一功能，本项研究将构建HYL1基因及其N端的基因表达载体，转入HYL1缺失突变体中；分离细胞质的不同组份，了解N端转录本和N端蛋白在核糖体中的分布；从核糖体中分离与HYL1结合的RNA，检测其中是否含有pri-miRNA、pre-miRNA和miRNA；进行核糖体体外miRNA加工，发现N端蛋白在核糖体内的功能；提出HYL1在细胞质中参与miRNA前体加工的新路径，为全面掌握miRNA生物合成的分子机制提供科学依据。

我们发现HYL1蛋白具有一个截断的N端转录本（nHYL1），该转录本含有前2个dsRBD结构域，但没有核定位信号和PPI结构域。nHYL1蛋白在细胞质和细胞核中均有分布，在细胞质中，nHYL1定位与AGO1重合，核糖体密度梯度离心发现其位于多聚核糖体中。在多聚核糖体组分中同时还检测到参与植物翻译抑制的miR168分布，但没有检测到其它不参与翻译抑制作用的miRNA的分布。nHYL1具有自身二聚化现象，同时和DCL1，SE具有相互作用，但和AGO1没有相互作用。CoIP实验和体外剪切实验证明在细胞内和体外重建系统中，nHYL1都能够参与miRNA前体的加工，说明其具有全长蛋白的活性。综上的结果显示，HYL1在核糖体中参与miRNA的前体加工，而这种前体加工产生的miRNA可能是与植物的翻译抑制现象相关。