HYL1在细胞质里调控microRNA对靶基因的翻译抑制

Primary transcripts (pri-miRNAs) are processed in the nucleus and release mature miRNAs into cytoplam after two steps of cleavage and control the gene silencing by cleavage and tranlation repression of miRNA-targeted genes. Our previous studies show that HYL1 is localized not only in nuclear but also in cytoplasm and that the fused proteins of HYL1 with cytoplam-localization signal (CLS) in the transgenic plants do not change the cleavage of miRNA-targeted genes but enhance plant ability of tranlation repression. The hypothesis is that HYL1 is involved in translational repression of miRNAs to their traget genes. To verify this hypothesis, we will use the loss-of-function mutants of HYL1 gene to study: the translational levels of HYL-CLS fused proteins; evaluate the ability of these proteins to regulate the cleavage and translation of the target genes; analyze the effects of HYL1 homodimerization on the cleavage and tranlation repression of miRNA-targeted genes; disclose the posibility and procedures for regulation of HYL1 to translational repression of miRNAs to their targete genes; and propose the molecular mechanism underlying the regulation of HYL1 to translational repression of miRNAs to their targete genes in cytoplasm.

miRNA前体（pri-miRNA）在细胞核中经过两步剪切加工为成熟的miRNA，在细胞质中行使靶基因RNA的降解和翻译抑制作用。我们的研究发现，HYL1 除了定位在细胞核中参与 miRNA 加工外，还同时定位在细胞质中，当HYL1与细胞质定位信号融合后其转基因植株中miRNA靶基因mRNA的剪切能力没有改变，但是翻译抑制的能力明显增强。由此推测，HYL1参与miRNA靶基因转录产物的翻译抑制。为了揭示这一现象的分子机制，我们准备以模式植物拟南芥HYL1基因突变体为研究对象，研究HYL1与细胞质定位信号融合蛋白在细胞质中的表达水平，了解这些融合蛋白对miRNA靶基因mRNA剪切和翻译抑制过程的调控能力，分析HYL1蛋白二聚化对其亚细胞定位和翻译调控的影响，解析HYL1在核糖体内参与靶基因翻译抑制的的可能性及过程，提出HYL1在细胞质中调控靶基因翻译抑制的分子机制。

在细胞核中，HYL1是DCL1重要的互作蛋白，其参与的 miRNA 加工过程一直被认为是 HYL1 的主要功能。然而我们发现 HYL1 缺失突变体中 miRNAs 种类和累积量无法解释其表型的建成，我们推测 HYL1 除了介导 miRNA 的转录后调控，可能还调控 miRNA 对靶基因的翻译抑制过程。为探究 HYL1 于细胞质中的功能可能性，我们构建了强入核信号介导的 HYL1 转基因植株(pHYL1::NLS40HYL1/hyl1-2, 即 NLS40HYL1)，以及强出核信号介导的 HYL1 转基因植株(pHYL1::NESHYL1/hyl1-2, 即 NESHYL1)。Small RNA-sequencing，Real-time quantitative PCR(RT-qPCR)，Northern blotting 以及表型测定等实验发现 NLS40HYL1 虽然能够完全恢复 hyl1-2 中 miRNA 加工的缺陷，但其仅能部分回复 hyl1-2 的突变体表型缺陷，同时 NESHYL1 并非 miRNA 加工所必须，但其却能够部分回复 hyl1-2 的表型缺陷，这表明细胞质 HYL1 具有一定的生物学功能。我们进一步发现虽然miRNA靶基因的mRNA水平在组间一致(NLS40HYL1vsWT; NESHYL1 vs hyl1-2)，但靶基因蛋白水平却不一致(NLS40HYL1 高于 WT，NESHYL1 低于 hyl1-2)，这表示细胞质中的 HYL1 能够抑制 miRNA 靶基因蛋白翻译。随后 Cu2+诱导实验以及 GFP 报告系统的构建等实验发现细胞质中 HYL1 介导的翻译抑制并非广谱， 而是依赖于miRNA。进一步研究发现，HYL1与ARGONAUTE1(AGO1)和ALTERED MERISTEM PROGRAM(AMP1)在体内互作，且定位于内质网上。RIP-qPCR 结果发现 HYL1 在细胞质中能特异与靶基因 mRNA 结合。以上结果表明 HYL1 在细胞质中与 AGO1 和 AMP1 互作，结合 miRNA 靶基因 mRNA 并对其进行翻译抑制。这一结果丰富了 miRNA 的转录后基因沉默调控机制，并为进一步研究 miRNA 介导的转录后沉默机制提供了新的方向。