莲WRKYs转录因子调节高温胁迫响应的分子机理

Lotus (Nelumbo nucifera Gaertn) is one of the oldest plants before the ice age. Lotus and Metasequoia are known as the "two greatest plants in China". The seeds of lotus are identified by scientist as the most high-temperature resistant seeds. In agricultural production and landscape application process, lotus also exhibit extremely hot tolerance. High temperature stress is a serious challenge for modern agriculture system worldwide. Separation of high-temperature related genes and genetic engineering of plants to improve heat resistance are important goals for modern breeders. In our previous work, using the genome sequences and annotation information for reference, we constructed the first high-temperature treated digital gene expression library in lotus. From the results, we found that WRKY is the largest transcription factor gene family responsive for high-temperature stress. In this work, we use asexually propagated plants as experimental materials, and the gene expression pattern, protein subcellular localization and gene function of WRKYs will be studied. The implementation of this work is expected to provide new experimental evidence for heat-resistant mechanism of lotus, and will also provide gene resources for plant heat-tolerance breeding.

莲(Nelumbo nucifera Gaertn)是冰期以前的古老植物之一，它与水杉被誉为"中国的两种绝妙植物"。莲种子是经科学鉴定的最耐高温的植物种子。在农林生产和园林应用过程中，莲也表现出非常强的高温耐性。高温胁迫是世界现代农业体系面临的严峻挑战，分离耐高温基因并通过基因工程改善植物耐热性是当代育种工作者的重要目标。在前期的研究工作中，我们以莲基因组序列和注释信息为参考，构建了莲首个高温胁迫下的表达谱，并发现WRKY是响应莲高温胁迫的最大的转录因子家族。本研究以中国莲幼苗为试材，拟进一步从基因表达模式、蛋白亚细胞定位、基因功能等方面，深入探讨莲WRKYs转录因子在高温逆境响应中的作用。本项目的实施有望为解析莲耐热分子机理提供新的实验证据，并将为植物耐热分子育种提供基因资源。

莲种子是经科学鉴定的最耐高温的植物种子。在农林生产和园林应用过程中，莲也表现出非常强的高温耐性。我们对莲转录组差异表达的6个NnWRKY转录因子基因进行了高温下的表达模式分析。发现NnWRKY1 、NnWRKY4、 NnWRKY5这3个基因随着高温胁迫处理的时间表达量显著上升，尤其是NnWRKY1在高温胁迫0.5h后表达量上升了20倍以上；NnWRKY2和NnWRKY3的表达随着热胁迫处理时间的延长而显著下调，NnWRKY6在处理前期表达量变化不大，高温处理12h以后表达量迅速上升。以上结果表明，NnWRKY1可能在荷花高温胁迫响应发挥重要作用。我们采用RACE克隆了NnWRKY1全长，其cDNA全长1321bp， 5’非编码区149bp，3’非编码区200bp，开放阅读框972bp，编码324个氨基酸。NnWRKY1有且仅有1个WRKY结构域，在WRKY结构域的上游有1个锌指结构域（pfam10533），该基因还包含一个HARF结构基序，因此推测NnWRKY1属于Ⅱd家族蛋白。组织特异性分析结果表明，NnWRKY1基因在荷花花朵的雄蕊中表达量最高，推测可能与花粉发育有关。亚细胞定位结果显示，NnWRKY1-GFP蛋白定位于细胞核内。我们采用VIGS在莲幼苗中进行了NnWRKY1基因沉默。在沉默植株中，与对照TRV2相比较， NnWRKY1的转录本丰度为对照的40 %左右。经过高温胁迫处理发现，莲NnWRKY1沉默植株的高温耐性显著下降，种子胚轴的伸长受到显著抑制。将NnWRKY1在拟南芥中进行超表达，发现高温处理2d后，转基因的种子萌发率为76.7%，野生型的萌发率为45.2%；高温处理5d后，转基因的种子萌发率达到91.5%，野生型的萌发率为68.6%；转基因种子在高温胁迫后的萌发能力显著高于野生型；以上结果表明，超表达NnWRKY1基因增强了拟南芥种子对高温胁迫的耐受能力。项目从基因表达模式、蛋白亚细胞定位、基因功能等方面，探讨了莲WRKY转录因子在高温逆境响应中的作用。项目的实施为解析莲耐热分子机理提供了新的实验证据，并将为植物耐热分子育种提供基因资源。