免疫B细胞抗体多样化中NHEJ2调控DNA损伤修复的机制研究

Antibody diversification processes, including V(D)J recombination and class switch recombination (CSR), diverse antibody gene sequences to generate an enormous antibody repertoire. Programmed DNA lesions specifically occur on antibody genes, which finally channeled into different sequences through multiple DNA damage response and repair pathways. We did a genetics screening with a focused CRISPR knockout library for CSR factors, which revealed a panel of critical genes including several poor-studied genes. Here, we focused on an unknown gene whose deficiency yielded most dramatic CSR defect. The gene was named as NHEJ2 based on our preliminary results. We will first validate the function of NHEJ2 in V(D)J recombination and CSR. Then, we plan to identify Nhej2 interaction proteins, and study the recruitment of Nhej2 to DNA double-strand breaks. Finally, we propose to explore the roles of NHEJ2 in hematopoietic stem cell and lymphocytes development with Nhej2-deficient mouse models. The uncovered mechanisms could provide new insight to antibody diversification and potential therapeutic approach for bone marrow failure and immunodeficiency.

免疫B细胞需经历V(D)J重排、抗体类型转换等多样化过程，以表达高效力抗体来应对各种病原体的入侵。这一过程中，程序性DNA损伤特异地发生于抗体基因区域，并由各种DNA损伤应答修复途径转换为多样的DNA序列。项目前期工作聚焦于DNA损伤修复相关基因，采用CRISPR敲除文库筛选方法，鉴定到一系列的抗体类型转换关键因子，包括若干未知功能基因。针对其中严重影响抗体类型转换效率的NHEJ2基因，本项目拟利用免疫学、细胞生物学和小鼠模型等方法，解析NHEJ2在抗体多样化中的作用机制。拟将在细胞系中验证NHEJ2在抗体多样化中的功能；进一步在分子水平剖析其相互作用因子以及Nhej2蛋白在DNA损伤处的招募；最后将利用Nhej2缺陷小鼠模型，研究其对淋巴细胞发育和骨髓造血功能的影响。预期将从分子、细胞、个体多个层次阐明NHEJ2调控DNA损伤应答修复的机制，为相关遗传性血液病的诊疗提供新的理论基础。

抗体是体液免疫中识别各种病原体的分子基础。伴随着B细胞的发育，抗体基因在体内经历V(D)J重排、抗体类型转换等各种多样化的过程，最终编码特异、高效的抗体蛋白。这一过程中，抗体基因区域会发生程序性DNA双链断裂损伤，并由DNA损伤修复通路进行修复。我们前期工作采用遗传学筛选鉴定到新的DNA损伤修复基因ERCC6L2（即本项目的NHEJ2）基因。携带ERCC6L2基因突变的骨髓衰竭综合征患者表现出严重的血小板缺乏、贫血和骨髓发育异常等症状。但是，ERCC6L2的功能及其致病机理仍然未知。. 在本项目的资助下，项目团队对ERCC6L2在抗体多样化中的功能进行了全面解析，并阐明了它在非同源末端连接通路中的作用。首先，我们研究了ERCC6L2蛋白在抗体类型转换中的功能，发现ERCC6L2缺失会显著地降低抗体类型转化效率。通过蛋白结构域的解析，我们发现ERCC6L2的C端结构域迅速招募到DNA损伤位点，其N段Helicase酶活结构域是其发挥功能所必需的。其次，我们剖析了ERCC6L2在V(D)J免疫重排中的功能，发现ERCC6L2与非同源末端连接通路中的XLF功能冗余。再次，我们解析了ERCC6L2在非同源末端连接通路中的分子机制，发现ERCC6L2能够与非同源末端连接通路的多个因子KU70/KU80和MRI等发生相互作用。最后，我们发现ERCC6L2调控抗体类型转换过程中DNA末端方向特异性连接，并且该功能依赖于它的Helicase酶活活性。我们的这些研究结果表明ERCC6L2作为一个新的非同源末端连接通路因子，通过调控DNA末端连接的方向性促进程序性DNA重排。. 本项目资助所产生研究成果已发表在Cell Research期刊。我们这些研究结果阐明了DNA损伤修复新因子ERCC6L2在抗体多样化中的作用机制，有利于我们深入地认识免疫缺陷、骨髓衰竭综合征等疾病的发病原理。