月季高温胁迫响应转录因子WRKY的分离与功能解析

High temperatures in summer restrict the application of Rosa hybrida in the landscape and cut flowers production in south of China. Many researches showed that WRKY transcription factors play a main and positive role in the heat stress-responsive of plant. With regard to the development of WRKYs of plants and the thermotolerance of R. hybrida, ‘Black Lady’, a moderate thermotolerance cultivar, is employed in our research. By using the high-throughput sequencing technology, we will study the transcription and expression profilings of the ‘Black Lady’ under heat treatment at different periods of time, and comprehensively scan all heat stress-responsive genes. Important WRKYs were selected by bioinformatics analysis of these genes. Functions of these important WRKYs will be identified by transformation of Arabidopsis thaliana and R. hybrida ‘Samantha’ with the plant expression vectors such as 35S:: WRKY-GFP and RNAi, and the target genes of transcription factors will be identified through ChIP-seq analysis of transgenic plants. Meanwhile, the yeast two-hydrid cDNA library of ‘Black Lady’ under heat stress will be constructed to identify other proteins interacting with WKRYs. The implementation of this project will identify some thermotolerance genes of R. hybrida, and clarify the molecular mechanism of WRKYs under heat stress. Moreover, the transgenic plants obtained will lay the foundation for further research.

我国南方夏季高温限制了月季（Rosa hybrida）在园林中的应用及切花的生产，大量研究表明WRKY转录因子在植物响应高温胁迫过程中起着十分重要的作用。针对目前植物WRKY转录因子的发展趋势与月季抗热的问题，本项目选取了月季中抗热性较好的品种‘黑夫人’为材料，采用高通量测序方法，通过对‘黑夫人’在高温处理下不同时间段的转录组及表达谱进行研究，扫描得到高温胁迫响应基因，并通过生物信息学分析挑选出重要的WRKY类基因。分别构建GFP融合载体、RNAi等不同形式的植物表达载体，通过转化拟南芥及月季耐热较差品种‘萨蔓莎’，验证基因功能，并对转基因植株进行ChIP-seq分析，发掘其调控的靶基因。同时构建‘黑夫人’高温胁迫下的酵母双杂交cDNA文库，钓取与WRKY转录因子互作的蛋白。项目的实施不仅可以开发月季抗热性相关基因，揭示WRKY转录因子在高温胁迫下的分子机理，而且有望创造月季抗热新品种。

本课题对高温胁迫下不同时间的月季进行了转录组测序，获得的月季响应高温胁迫的表达谱，通过对表达谱分析筛选得到6,175个差异表达基因，通过这些差异基因的表达量结合GO和KEGG代谢途径富集分析，鉴定出一系列参与高温响应的候选基因，其中HSPs，转录因子，ROS-相关基因，信号转导基因为持续显著上调表达基因。进一步对响应高温胁迫的转录因子分析发现，HSF，DREB, WRKY, AP2/ERF，MYB，NAC，bHLH，bZIP 为代表的转录因子在高温胁迫下表现出不同的表达模式，其中HSF, NAC, DREB2C类转录因子在胁迫过程中上调表达量较高，为高温胁迫时的主导响应转录因子。进一步克隆了HSF30（HSFA2a），HSFB2a， NAC019和 DERB2C四个基因，并构建载体。另一方面全面筛选了月季WRKY家族基因63个。根据功能域特性和保守基序将这63个转录因子分为GroupⅠ，Ⅱ和Ⅲ三类；通过高温胁迫下的表达量分析，表明月季中有22个WRKY类基因的表达量受到高温胁迫的显著影响，且大部分表现为下调表达，只有一个RcWKRY23表现为上调表达。表明WRKY转录因子在月季响应高温胁迫中起负调控作用。选择其中响应较为明显的4个WRKY基因，克隆得到其CDNA全长，通过生物信息和比对分析，鉴定为RcWRKY23，RcWRKY40，RcWRKY11和RcWRKY53。将这些基因构建载体转化拟南芥和月季，结果表明超量表达RcWRKY23基因拟南芥的耐热能力显著高于野生型；同时获得了转基因的月季的抗性体细胞胚和抗性芽。此外，本项目还建立了月季高温胁迫酵母双杂交文库。项目中克隆得到的基因，构建的载体将为后期通过基因工程手段改良植株耐热性奠定了分子基础，获得的转基因植物将为进一步了解月季耐热性的分子机制做出了贡献。