基于NF-KB信号通路的长白山药用植物紫穗槐活性成分抗炎机制研究

In our search for NF-κB inhibitors from natural resources, we found Amorfrutin as inhibitors of NF-κB activation from amorpha fruticosa, medicinal plants in Changbai Mountain. This compound not only inhibited NF-κB transactivation but also suppressed mice inflammatory responses, suggesting that the amorfrutin plays an important role in NF-κB mediate inflammatory responses, but the exact mechanism is unclear. In this study we investigate the effect of amorfrutin on NF-κB activation in LPS-stimulated RAW264.7 cells, TNF-α-stimulated Hep3B cells, and LPS-induced mice inflammatory responses. In addition, using immunoprecipitation, western blot, electrophoretic mobility shift assay, and flow cytometer to determine how amorfrutin regulates the NF-κB signaling pathway. Furthermore, using mice inflammatory response models to explore the role of amorfrutin in NF-κB signaling pathway. This research may extend our understanding on the molecular mechanisms underlying the diverse biological activities of amorfrutin.

本课题组在前期工作中发现长白山药用植物紫穗槐果实中的活性单体成分（Amorfrutin）对小鼠巨噬细胞RAW264.7和肝癌细胞Hep3B中NF-κB表达和转录活性及小鼠炎症反应有明显的抑制作用，因此认为Amorfrutin 可能干预了NF-κB信号转导途径介导的炎症反应，然而其确切机理尚不清楚。项目内容拟对Amorfrutin干预炎症反应的作用机制进行研究。采用体内外相结合实验，通过免疫共沉淀、免疫蛋白印迹、电泳泳动度移动和流式细胞等现代分析技术，以NF-κB为切入点，探索Amorfrutin对NF-κB信号转导通路的调控机制，并利用脂多糖（LPS）诱导炎症反应小鼠模型探讨Amorfrutin在炎症发生、发展中的作用机制。通过本项目研究可以阐明Amorfrutin干预NF-κB信号转导通路介导的炎症发生、发展的分子机制，研究结果将为紫穗槐活性成分抗炎药物的开发研究提供可靠的药理学资料。

Amorfrutin是我们课题组从长白山药用植物紫穗槐果实中提取的一种活性单体化合物，尚未见国内外有解析该种化合物在NF-κB—STAT3信号转导途径及炎症和肿瘤反应中作用机理的研究报道。本研究（1）利用双荧光素酶报告基因系统，明确观察到Amorfrutin 抑制NF-κB的转录活性；明确观察到Amorfrutin 可剂量性地抑制IκBα蛋白降解、p65核移位及NF-κB与DNA的结合活性；利用Western blot明确观察到Amorfrutin 抑制了NF-κB下游靶基因cIAP1、FLIP、Cyclin D1、MMP9、VEGF和COX2蛋白表达水平；利用RT-PCR明确观察到Amorfrutin 抑制MCP1、IL-8和TNF-α mRNA的表达；采用流式细胞仪分析技术，明确观察到Amorfrutin 可增强TNF-α诱导的细胞凋亡。其次对（2）在TNF-α、IL-6和EGF诱导状态下，明确观察到Amorfrutin 对STAT3的转录活性有明显的抑制作用；利用Western blot法，检测到Amorfrutin 可剂量性抑制TNF-α诱导的STAT3的磷酸化；利用免疫荧光实验，明确观察到Amorfrutin 可抑制TNF-α诱导的STAT3的核易位；利用Western blot法，明确观察到Amorfrutin 可剂量和时间依赖性抑制TNF-α诱导的JAK1、JAK2、Src的磷酸化；Amorfrutin 可明显抑制STAT3下游靶基因的表达；利用Edu实验，明确观察到Amorfrutin 可抑制细胞增值；利用流式细胞仪分析技术，明确观察到Amorfrutin 可抑制TNF-α诱导G1细胞周期阻滞；利用Western blot实验，明确观察到Amorfrutin 可明显调控细胞增值相关蛋白；利用小鼠模型，明确观察到Amorfrutin 可明显抑制了裸鼠皮下移植瘤的生长。（3）本研究团队在进行Amorfrutin抗炎、抗肿瘤筛选中发现一些其他类型的单体化合物，如dihydrotanshinone、Malloapelta B、Baicalein、Dihydromyricetin、Perillyl alcohol和4’,6-Dihydroxy-4-methoxyisoaurone等有较好药理活性，揭示了其作用机理，为后续的抗炎、抗肿瘤药物的开发提供了理论基础。