ZFP91,一个调控HIF-1α信号转导通路和肿瘤生长与转移的新分子的作用研究

我们是国际上率先对锌指蛋白91（ZFP91）的具体功能进行报道的单位，在前期工作中发现ZFP91可能通过调节缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）信号转导通路参与肿瘤的生长；上调ZFP91能够诱导HIF-1α表达和活化，并且能够明显促进肝癌细胞增殖和肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，因此认为ZFP91在肿瘤生长中起重要的作用，然而其确切机理尚不清楚。本研究拟利用基因过表达、显性失活突变和RNA干扰技术改变ZFP91在肝癌细胞中的表达和功能，借助体内外实验研究ZFP91对细胞增殖和侵袭的影响，通过免疫共沉淀、免疫荧光和电泳泳动度移动分析等技术，以HIF-1α为切入点，探索ZFP91在HIF-1α信号转导通路中的调控机制，并利用裸鼠接种肿瘤模型探讨ZFP91在肿瘤生长与转移中的作用。若能证明ZFP91是一个新的肿瘤生长与转移调控分子，可为深入理解肿瘤生长与转移的分子事件，探讨新的基因治疗方法奠定基础。

锌指蛋白91（ZFP91）是一类具有手指状结构域的转录因子，其除在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育等方面具有重要的作用外，且与肿瘤等多种疾病的发生发展过程密切相关，然而其确切机理尚不明确。实体肿瘤内存在缺氧环境，肿瘤缺氧微环境影响肿瘤细胞的基因表型，激活多种癌基因，其中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是肿瘤缺氧反应中关键性因子，也是调节肿瘤新生血管生成、能量代谢、细胞增殖、侵袭和转移等相关基因的上游转录调节蛋白。本研究（1）利用多种类型肿瘤患者组织进行了ZFP91蛋白表达情况研究，明确观察到ZFP91在结肠癌中表达高于其他肿瘤组织中的表达；利用免疫组化染色技术对结肠癌患者进行分析，明确观察到在人结肠癌组织中ZFP91蛋白的表达量明显高于癌旁组织。（2）在分子水平上利用双荧光素酶报告基因系统证实了ZFP91对HIF-1α的转录活性有明显的激活作用；利用Western blot和RT-PCR证实了ZFP91对HIF-1α及其下游靶基因VEGF和EPO mRNA和蛋白质表达有明显的促进作用；利用免疫共沉淀技术及免疫荧光技术证实了ZFP91、HIF-1α及p65共同定位于细胞核内；利用Chip及电泳泳动度移动分析测定了ZFP91、p65与HIF-1α启动子相互结合位点。（3）在细胞水平上利用噻唑蓝比色分析法和软琼脂单克隆形成实验明确观察到ZFP91促进了HIF-1α介导的肿瘤细胞增殖；利用EdU assay明确观察到ZFP91促进了HIF-1α介导的肿瘤细胞增殖和侵袭；利用流式细胞术明确观察到ZFP91促进了HIF-1α介导的肿瘤细胞生长周期。（4）在裸鼠接种肿瘤生长与转移研究执行中，利用裸鼠皮下移植瘤模型明确观察到ZFP91促进了HIF-1α介导的裸鼠皮下移植瘤的生长；同时利用Western blot明确观察到ZFP91促进了肿瘤组织中HIF-1α、VEGF和EPO蛋白质的表达。（5）以ZFP91及其相关蛋白为药物作用靶点初步建立了高通量活性筛选平台，对长白山药用植物进行了活性筛选并筛选出多种活性单体化合物，为后续的抗肿瘤药物的研究及开发奠定了坚实的理论基础。