以番茄果实为受体表达结核分枝杆菌Ag85B-ESAT-6-WbbL融合蛋白及免疫效应研究

疫苗是预防和控制结核病的最佳途径，目前国内外应用的只有卡介苗一种，而其预防效果存在较大争议，急需研制新型有效的结核疫苗。基于结核分枝杆菌特异性抗原的融合亚单位疫苗是目前研究的主要方向之一，Ag85B、ESAT-6和WbbL蛋白可作为研发结核疫苗的理想靶抗原。转基因植物作为生物反应器生产口服疫苗为医用结核疫苗的生产提供了新途径。本项目在克隆结核分枝杆菌fbpB、esat-6和wbbL基因的基础上，获得fbpB-esat-6 -wbbL融合抗原编码基因；通过马铃薯X病毒、携带番茄果实特异启动子TFP 载体介导其在番茄果实中进行瞬时及核稳定遗传定向表达，获得特异的融合抗原蛋白以及稳定遗传的转基因番茄株系；观察评价所得到的纯化抗原蛋白和转基因番茄果实的小鼠免疫原性及保护、治疗效果，阐明各种抗原物质的动物免疫应答机制。本项目研究将为研制和开发新型的人畜共用结核疫苗提供新材料并奠定理论基础。

结核病是世界性的社会经济问题，尤其是在发展中国家，严重威胁人类的生命健康。疫苗是预防和控制结核病的最佳途径，但目前国内外临床应用的只有卡介苗一种，且其预防效果存在较大争议，急需研制新型有效的结核疫苗。国内外最新研究表明，Ag85B、ESAT-6抗原蛋白可作为研发结核疫苗的理想靶抗原。WbbL为结核分枝杆菌特有的胞外功能蛋白，序列结构保守，种属特异性高，存在潜在抗原表位，很可能作为分枝杆菌感染的特异性分子标志。转基因植物作为生物反应器生产口服疫苗为医用结核疫苗的研发提供了新途径。本研究首先应用PCR、SOE-PCR技术克隆获得了fbpB、esat-6、wbbL基因及fbpB-esat-6、fbpB-esat-6-wbbL融合基因，通过基因工程技术，构建了携带各单基因及融合基因的原核表达载体。IPTG作为诱导剂诱导蛋白表达，SDS-PAGE分析表明在大肠埃希菌中表达出了Ag85B、ESAT-6、WbbL、Ag85B-ESAT-6及Ag85B-ESAT-6-WbbL蛋白。应用PCR技术对基因结构进行改造，获得了适合植物表达的各单基因及融合基因，然后将其构建于PVX载体pGR107及植物二元载体pBI121、pEV上。通过植物转基因技术侵染烟草及番茄，在侵染液OD600介于0.8~1.0之间时，侵染效果最佳。通过pGR107-GFP所携带的绿色荧光蛋白及pBI121、pEV所携带的GUS检测确定了外源蛋白的最高表达时间阶段。提取烟草叶片总蛋白SDS-PAGE分析表明外源蛋白在烟草中获得了表达，获得了纯化蛋白，番茄中外源蛋白的表达量过低或无表达。初次免疫-加强免疫策略免疫小鼠动物实验结果表明，各蛋白均有良好的免疫原性，可激发产生以Th1型为主的细胞免疫应答，原核表达及植物表达的蛋白免疫效果几乎一致。与NS对照组相比，激发小鼠产生的血清特异IgG、IFN-γ及IL-2水平显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。本研究为研制和开发新型的人畜共用结核疫苗提供了新思路、新材料并奠定了一定的理论基础，对防治结核病具有较大的临床意义。